Primer Mast Hücrelerini Murin Periton Boşluğundan İzole Etme Tekniği

Özet

Kaynak: Tsvilovskyy, V., et al. Periton Kaynaklı Mast Hücrelerinin İzolasyonu ve Ca²⁺-görüntüleme ve Degranülasyon Testleri ile Fonksiyonel Karakterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, yetişkin farelerin periton boşluğundan olgun bağ dokusu tipi mast hücrelerini izole etmek için bir periton lavaj yöntemini göstermektedir. Periton boşluğundan primer immün hücrelerin bir karışımı izole edildikten sonra, uygun kültür koşulları altında mast hücrelerinin seçici proliferasyonu gerçekleştirilir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

>1. İntraperitoneal lavaj ile PMC izolasyonu

1. Hücre izolasyonundan önce, Tablo 1'de listelenen malzemeleri hazırlayın.
2. PMC izolasyonu için 8 ila 14 haftalık erkek fareler kullanın. Bir fareyi CO₂ soluyarak ötenazi yapın ve refleks kaybıyla ölümü doğrulayın. Fareye %70 etanol püskürtün ve pimleri kullanarak (sırt tarafı aşağı) bir köpük blok üzerine sabitleyin. Künt kenar makası kullanarak farenin ventral derisini çıkarın. Periton boşluğuna zarar vermekten kaçının.
   not: Tipik olarak bu protokolü, C57BL / 6N suşu genetik geçmişine sahip fareler için kullanırız.
3. 27 G iğne ile donatılmış 10 mL'lik bir şırınga kullanarak periton boşluğuna 7 mL buz gibi soğuk RPMI ortamı ve 5 ml hava enjekte edin. İğneyi peritonda dikkatlice itin ve herhangi bir organı delmeyin. Organ perforasyonu riskini azaltmak için epididimal yağ bölgesinde bir nokta kullanın.
4. Enjeksiyondan sonra, periton hücrelerini RPMI ortamına ayırmak için fareyi 1 dakika sallayın. İç organlara zarar vermemek ve periton boşluğunu kanla kirletmemek için fareyi çok güçlü bir şekilde sallamayın.
5. 10 mL'lik şırıngayı yeni bir 20 G kanül ile donatarak yeniden kullanın. Köpük bloğu eğerek ve diğer taraftan orta aspirasyonu kolaylaştırmak için tezgahın üzerine hafifçe vurarak iç organları bir tarafa kaydırın. 20 G'lik bir iğne yerleştirin, eğim verin ve iç organların tıkanmasını önlemek için sıvıyı karın bölgesinden nazikçe ve yavaşça (~ 0.5 mL / s) aspire edin. Mümkün olduğunca fazla sıvı toplayın (tipik olarak 5-6 mL).
6. İğneyi şırıngadan çıkarın ve toplanan hücre süspansiyonunu buz üzerindeki bir toplama tüpüne aktarın. Görünür kan kontaminasyonu varsa bir numune tüpünü atın.
7. Tüpleri hücre süspansiyonu ile ~ 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Steril bir başlık altında süpernatanı aspire edin. Her fare için, numune peletlerini 4 mL soğuk (4–10 °C) PMC Ortamında birleştirin ve hücre süspansiyonunu 25^cm2'lik bir kültür şişesine aktarın. Büyüme faktörleri IL-3 ve SCF'yi sırasıyla 10 ng / mL ve 30 ng / mL'lik nihai konsantrasyonlara ekleyin. Hücreleri içeren şişeyi bir inkübatöre (37 °C ve% 5 CO₂) yerleştirin ve bir sonraki prosedüre kadar ~ 48 saat inkübe edin.

Tablo 1: Adım 1 için malzemeler.

1	buz
2	10 mL şırınga
3	27 G iğneler
4	20 gr iğne
5	Strafor blok ve pimler
6	Toplama tüpleri (50 mL Plastik Santrifüj Tüpleri)
7	% 70 etanol
8	RPMI Medium (Önceden soğutulmuş ve buz üzerinde tutulmuş)
9	PMC Ortamı: RPMI Orta +% 20 FCS (Fetal Buzağı Serumu) +% 1 Penisilin Streptomisin çözeltisi (Kalem-Strep)
10	Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin - DPBS (Ca2 + ve Mg2 + olmadan)
11	Kültür Mataraları (25 cm)
12	Büyüme faktörleri stok çözeltileri (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2,5 μg/mL)
13	Serolojik pipetler (10 mL)
14	Pipet uçları steril (20–200 μL)
15	Hemositometre
16	Tezgah Üstü Santrifüj
17	Makas ve forseps
18	Fareler için CO2 odası
19	Açık steril başlık
20	Kapalı steril başlık
21	Hücre inkübatörü (37 °C ve %5 CO2)
22	Transfer pipetleri (20–200 μL)

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
RPMI Orta	Termo Bilimsel	21875034
DPBS (DPBS)	Sigma-Aldrich	14190144
Fcs	Termo Bilimsel	R92157
IL-3 (İngilizce	Ar-Ge Sistemleri	403-ML
Scf	Termo Bilimsel	PMC2115
Penstrep Belediyesi	Termo Bilimsel	15140122
Kültür Mataraları (25 cm)	Greiner Bio-Bir	69160
15 mL Plastik Santrifüj Tüpleri	Sarstedt	6,25,54,502
Tezgah Üstü Santrifüj	Heraeus (Heraeus)	Megafüj 1.0R

Gazetesi Serisi ) Serisi Belediyesi