İnsan katılımcıları içeren tüm prosedürler, insan refahı için kurumsal, ulusal ve uluslararası yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiş ve yerel kurumsal inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Cihaz İmalatı ve Yumuşak Litografi
NOT: Polidimetilsiloksan (PDMS) mikrokanalını oluşturmak için standart yumuşak litografi teknikleri kullanıldı.
- PDMS öncüsünü 10:1 oranında baz ve kürleme maddesinde karıştırın.
- 30 g PDMS öncü karışımını mikro işlenmiş alüminyum kalıba (boyutlar için Şekil 1'e bakın) ve 20 g PDMS öncü karışımını 100 mm'lik Petri kabına dökün.
not: Petri kabı, destek tabakası için kalın PDMS filmini (~ 3 mm) yapmak için kullanılır. PDMS'nin destekleyici katmanı, mikroakışkanlar boyunca tek tip fiziksel yüzey özellikleri sağlar. Alternatif olarak, cam slayt üzerinde ince bir PDMS filmi kullanılabilir. Belirli kanal boyutlarına sahip ana kalıp, alüminyum levha üzerinde mikro frezeleme ile tasarlanmış ve üretilmiştir. Bu çalışmada kullanılan spiral kanal, bir giriş ve iki çıkışa sahip 8 halkalı bir spiral mikro kanaldı ve verimli boyuta dayalı ayırma için yarıçapı 8 mm'den 24 mm'ye çıkarıldı.
- Yüzeyde kabarcık görünmeyene kadar, tipik olarak 5-10 dakika arasında gazı gidermek için kalıbı ve Petri kabını bir vakumlu desikatöre yerleştirin. Desikatör için bir ev süpürgesi kullanın.
- Vakumu serbest bırakın ve kalıbı ve Petri kabını 1 saat < br / > için 90 ° C'lik bir fırına yerleştirin
not: Fırın yerine ocak gözü veya başka ısıtma araçları kullanılabilir.
- Kalıbı ve Petri kabını fırından çıkarın ve oda sıcaklığında 10 dakika soğumaya bırakın.
- Anahattı dikkatlice kesin ve 2 mm'lik bir zımba kullanarak cihazdaki sıvı erişim deliklerini açın.
not: Zımbanın boyutu, borunun veya sıvı kılavuzunun boyutuna bağlı olarak değişebilir.
- Cihazın kanal tarafına bir bant ve kalın bir PDMS filmi yapıştırın ve tozu temizlemek için forseps ile dikkatlice soyun.
- Cihazın hem kanal tarafına hem de düz PDMS'ye hava plazması uygulayın ve hazırlanan düz PDMS destek tabakası ile yapıştırın (Şekil 1A).
- Çipi 50 mm x 70 mm cam kızak üzerine yerleştirin ve yapışma gücünü artırmak için en az 30 dakika boyunca 70 °C fırına koyun.
2. Mekanik Ventilasyonlu Hastalardan Trakeal Sekresyon Toplanması
NOT: Trakeal sekresyonlar, normal rutin hava yolu bakımı sırasında mekanik olarak ventilasyon yapılan hastalardan, standart, yetişkin ventilasyonlu hastaya uyum sağlamak için geleneksel yöntemlerden modifiye edilmiş bir protokol kullanılarak elde edilebilir. Numunelerin kimlikleri gizlendi ve işlenmek üzere hemen gönderildi.
- Trakeal aspirasyon belirtilirse, hava yolu sekresyonlarını çıkarmak için bir kateter kullanın.
- Kateteri dikkatlice endotrakeal tüpün yarısına kadar ilerletin ve önceden doldurulmuş 10 mL'lik bir şırıngadan 5 mL% 0.9 steril normal salin damlatın.
- Kateter tamamen ilerlediğinde veya direnç oluştuğunda, salgıları aspire edin ve steril bir balgam toplama kabına toplayın.
- Steril bir balgam kabında 10 mL trakeal sekresyon toplayın ve buzun üzerine koyun. Numuneleri işlenmek üzere hemen gönderin.
3. Trakeal Sekresyon Örneği Hazırlama
NOT: Tüm deneyler, uygun kişisel koruyucu ekipmana sahip bir biyogüvenlik kabini altında yapılmalıdır.
- 1 mL hava yolu sekresyon numunelerini plastik 10 mL şırınga (10x seyreltme için) kullanarak 9 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde dağıtın. Mukus örneğini homojenize etmek için kör bir pipet kullanın.
- Mikroakışkanlar erişim deliğini veya kanalı tıkayabilecek büyük parçaları veya kan pıhtılarını çıkarmak için seyrelticiyi 40 μm'lik bir naylon hücre süzgeci ile süzün. İşlemden sonra numuneyi buzun üzerine yerleştirin.
- Her bir numunenin seyrelticisini 100x hacimde bir PBS tamponu kullanarak dağıtın, bu da 1.000x seyreltilmiş bir süspansiyon ile sonuçlanır. Tüm ayrıştırma işlemi boyunca numuneyi buzun üzerine yerleştirin.
4. Deney Düzeneği
NOT: Tüm deneyler, uygun kişisel koruyucu ekipmana sahip bir biyogüvenlik kabini altında yapılmalıdır.
- Dört spiral mikro kanalın her birine eşit akış uygulamak için PDMS çipini sıvı kılavuzuyla birleştirin (Şekil 1B).
not: Paralelleştirme yoluyla verimi artırmak ve elde edilen süspansiyonun hacminin ve hücre yoğunluğunun optimizasyonu için dört kanal kullanıldı. Akışkan kılavuzu, şeffaf reçineli stereolitografi tipi bir 3D yazıcı ile tasarlanmış ve yapılmıştır. Akışkan kılavuzunun giriş ve çıkış portu, çalışma sırasında bağlantı kolaylığı ve sabit sızdırmazlık için dişi Luer konektörleri kullanır.
- Sıvı kılavuzunun girişine, iç duvar (IW) çıkışına ve dış duvar (OW) çıkış portuna 1/16 inç erkek Luer konektörü bağlayın ve s'ye bir silikon boru bağlayın.ampsüspansiyon.
- Numune haznesinin dibine ulaşmak için giriş ve çıkışların her iki ucuna kör uçlar sokun.
- Peristaltik pompayı giriş borusuna bağlayın.
- Giriş borusunun ve IW çıkış borusunun ucunu s'ye yerleştirinamprezervuar ve OW çıkış borusunun ucunu atık rezervuarına yerleştirin (Şekil 1C, D).
- Kalsiyum ve magnezyum içermeyen 50 mL'lik filtrelenmiş PBS tüpünü numune haznesine yerleştirin.
- Cihazı doldurmak için düşük bir akış hızında (~ 1 mL / dak) pompalamaya başlayın.
not: Kanalda kabarcıklar yakalandığında, hava kabarcıklarının dengesini bozmak ve ortadan kaldırmak için kanalın üst kısmını cımbızla itin. Cihaz tampon çözeltisi ile tamamen dolduğunda, hava yolu sekresyonunu hazırlamak için PBS tüpünü değiştirin.amptüp.
- Numune numune haznesine yerleştirildiğinde, peristaltik pompayı açın ve akış hızını 4 mL/dk'ya ayarlayın (Şekil 1C, D).
- Numune hacmi belirlenen hacme (~ 1 mL) ulaştığında, işlemi durdurun ve silikon borunun bağlantısını kesin.
not: Önerilen yöntem, büyük hacimli bir seyrelticiyi (>50 mL) bir mikro santrifüj tüp hacmine (~1 mL) indirgemede daha verimlidir (Şekil 2).
