Murin T Yardımcı Lenfositlerinin Radyoaktif İşaretli Monoklonal Antikorlar Kullanılarak Etiketlenmesi

Özet

Kaynak: Hoffmann, S. H. L., et al., PET/CT ile İn Vivo Hücre Kaçakçılığı için ⁶⁴Cu-Antikor Reseptörü Hedeflemesi ile Murin Lenfosit Etiketlemesi. J. Vis. Exp. (2017)

Bu videoda, non-invaziv pozitron emisyon tomografisi görüntülemesi için radyoaktif izotop konjuge monoklonal antikorlar kullanarak T yardımcı hücrelerinin hücre içi radyo-etiketlemesini gösteriyoruz.

Protokol

1. cOVA-TH1 Hücre Radyoetiketleme

NOT: ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb, hücre içi radyoaktif etiketlemeyi etkinleştirmek için kültürlenmiş cOVA-TH1 hücrelerine uygulanacaktır.

1. cOVA-TH1 hücre radyoetiketlemesi için, bir doz kalibratörü kullanarak ölü hacim olmadan bir şırıngada radyoaktif işaretli ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb'den 37 MBq çekin. 37 MBq / mL'lik bir çözelti elde etmek için 1 mL salin ekleyin.
2. cOVA-TH1 hücrelerini ortamda 2 x 10⁶ hücre / mL'de askıya alın ve 48 oyuklu bir plakada her bir oyuğa 0.5 mL hücre süspansiyonu ekleyin.
3. 48 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 20 μL taze hazırlanmış 37 MBq/mL ⁶⁴Cu-DOTA-KJ1-26-mAb çözeltisi ekleyin. Etiketleme için nihai oran, 520 μL'lik bir hacimde 10⁶ hücre başına 0.7 MBq'dir. 37 ° C'de ve% 7.5 CO_2'de 30 dakika inkübe edin.
4. İnkübasyondan sonra, her bir oyuktaki hücreleri dikkatlice yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 48 oyuklu plakadan 50 mL'lik bir vidalı kapaklı tüpe aktarın. Hücre kaybını en aza indirmek için, her bir kuyuyu önceden ısıtılmış bir ortamla durulayın.
5. cOVA-TH1 hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hücreleri 10 mL önceden ısıtılmış PBS'de yeniden süspanse edin. Hücre sayımı için hücre süspansiyonunun bir alikotunu çıkarın. Yıkama adımını tekrarlayın.
6. Canlı cOVA-TH1 hücrelerini, tripan mavisi boyama ile uygun bir seyreltmede sayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
64Cu çalışma modülü	WKL (İngilizce	Özel yapım	64Cu üretim
Doz kalibratörü	Capintec Teknolojisi	CRC-25R
PETtrace siklotron	General Electric Medikal Sistemleri
DOTA-NHS (Ulusal Sağlık Sistemi)	Makrosiklikler	B-280
Anti-cOVA-TCR antikoru (KJ1-26)		Hibridoma hücre kültüründen izole edilmiştir	DOTA-konjugasyon
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	71633	DOTA-konjugasyon
H+ Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901	DOTA-konjugasyon
Amicon Ultra-15 filtre ünitesi	Merck Kırlangıç	UFC910008	DOTA-konjugasyon
Rotipuran ultra saf su	Carl Roth'un fotoğrafı	HN68.3	DOTA-konjugasyon
Amonyum asetat	Sigma-Aldrich	32301	DOTA-konjugasyon
Pbs	Tuebingen Üniversitesi		DOTA-konjugasyon
Mikro Bio-spin P-6 sütunu	Bio-Rad Laboratuvarları	7326221	DOTA-konjugasyon
Sodyum sitrat	Sigma-Aldrich	71497	DOTA-konjugasyon
Siklon Artı Fosfor Görüntüleyici	Perkin-Elmer	L2250116	DOTA-konjugasyon
DMEM (Ömer Çiçeğ	Merck Kırlangıç	102568	T hücresi ortamı için bileşen
Fcs	Merck Kırlangıç	S0115/1004B	T hücresi ortamı için bileşen
Sodyum piruvat	Merck Kırlangıç	L0473	T hücresi ortamı için bileşen
MEM-amino asitler	Merck Kırlangıç	K0293	T hücresi ortamı için bileşen
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Merck Kırlangıç	L 1613	T hücresi ortamı için bileşen
Penisilin / Streptomisin	Merck Kırlangıç	A2212	T hücresi ortamı için bileşen
0,05 mM 2-β-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148	T hücresi ortamı için bileşen
DO11.10 fareler		Ev içi ıslah	TH1 hücre kültürü
DPBS (DPBS)	Gibco (Gibco)	14190144	TH1 hücre kültürü
Hücre süzgeci 40 μm	Corning	352340	TH1 hücre kültürü
ACK Lizing Tamponu	Fransa	10-548E	TH1 hücre kültürü
CD4 Mikro Boncuklar, fare	Miltenyi Biyoteknoloji	130-097-145	TH1 hücre kültürü
QuadroMACS ayırıcı	Miltenyi Biyoteknoloji	130-090-976	TH1 hücre kültürü
LS sütunu	Miltenyi Biyoteknoloji	130-042-401	TH1 hücre kültürü
Anti-CD4 antikoru (Gk1.5)		Hibridoma hücre kültüründen izole edilmiştir	TH1 hücre kültürü
Anti-CD8 antikoru (5367.2)		Hibridoma hücre kültüründen izole edilmiştir	TH1 hücre kültürü
Anti-sıçan antikoru (MAR18.5)		Hibridoma hücre kültüründen izole edilmiştir	TH1 hücre kültürü
Tavşan tamamlayıcısı MA	tebu-Biyografi	CL3221	TH1 hücre kültürü
Anti-IL-4 antikoru (11B11)		Hibridoma hücre kültüründen izole edilmiştir	TH1 hücre kültürü
cOVA 323-339-peptit	EMC-mikro koleksiyonlar	Özel sipariş	TH1 hücre kültürü
CPG1668-oligonükleotidler	Eurofins MWG Operonu	Özel sipariş	TH1 hücre kültürü
IL-2 (İngilizce	Novartis Bilişim	65483-116-07	TH1 hücre kültürü
96 oyuklu plakalar	Greiner	655180	TH1 hücre kültürü
24 oyuklu plakalar	Greiner	662160	TH1 hücre kültürü
Hücre kültürü şişesi	Greiner	660175	TH1 hücre kültürü
48 oyuklu plakalar	Greiner	677 180	Hücre etiketleme
Gama hücresi 1000	En İyi Theratronics	Soruşturma yoluyla
Gülmay RT225	Gülmay	Soruşturma yoluyla
Tripan mavisi	Merck Kırlangıç	L6323	In vitro değerlendirme

) Serisi Serisi Gazetesi Gazetesi Serisi . Gazetesi Gazetesi Serisi Serisi Serisi Serisi Gazetesi Serisi Serisi ) Sistemleri numaralı telefonu arayın Serisi