$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Reaktif ve Malzeme Hazırlama
- % 2 fetal sığır serumu (FBS) ve 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) içeren 500 mL fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın.
not: En iyi sonuçlar için tamponu tüm prosedür boyunca buz üzerinde tutun.
- RPMI 1640,% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin içeren 50 mL tam RPMI ortamı hazırlayın. THGM hücre farklılaşması için 50 μM β-merkaptoetanol içeren tam RPMI ortamı kullanın. β-merkaptoetanolü bir davlumbaza ekleyin.
- Anti-CD3e konsantre stoğunu PBS'de 3 μg / mL'ye seyrelterek 7.5 mL'lik bir anti-CD3e antikor karışımı hazırlayın. Her bir oyuklu plakaya 150 μL antikor karışımı ekleyerek 48 oyuklu plakaları kaplayın ve plakayı en az 1 saat boyunca 37 ° C'de veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
- Bir makas ve forseps sterilize edin ve diseksiyonlar arasında% 70 etanol içinde tutun.
2. Murin Splenositlerinin Hazırlanması
- Kurumsal olarak onaylanmış bir CO2 asfiksisi veya servikal çıkık kullanarak fareyi (6-8 haftalık) ötenazi yapın. Fareye% 70 etanol püskürtün ve sırtındaki polistiren bir bloğa monte edin. Aşağıdaki adımlara devam etmek için fareyi biyolojik bir güvenlik kabinine aktarın.
- Cildi bir çift forseps kullanarak tutun ve bir makas kullanarak sol taraftaki göğüs kafesinin altındaki cildi yaklaşık 4 cm kesin. Dalağı ortaya çıkarmak için periton kesesini açın ve dalağı çıkarmak için steril forseps kullanın.
- 50 mL'lik bir tüpe 70 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve 2 mL tamponla önceden ıslatın. Dalakları hücre süzgecinin üzerine yerleştirin (bir hücre süzgeci için 2-3 dalak) ve 5 mL'lik bir şırınga pistonunun ucunu kullanarak yumuşatın.
- Süzgeci ve tüpü, tüm hücreler tüpe atılana kadar 1-2 mL hücre izolasyon tamponu ile birkaç kez durulayın. Hücre süzgecini atın ve hücreleri 350 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
- Hücre peletini 5 mL soğuk (4 °C) amonyum-klorür-potasyum (ACK) parçalama tamponu (150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA; pH 7.2-7.4) ile yeniden süspanse edin ve 2 dakika boyunca hafifçe karıştırın. ACK tamponunu nötralize etmek için 10 mL tam RPMI ortamı ekleyin ve hücreleri hemen 350 x g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı atın.
3. Manyetik CD4 mikroboncukları ve bir hücre ayırma sütunu kullanılarak CD4+ T hücrelerinin izolasyonu
- Hücre peletini 5 mL hücre izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Herhangi bir kalıntıyı temizlemek için bir ön ayırma filtresi (30 μm) kullanarak hücre süspansiyonunu yeni bir 15 mL'lik tüpe filtreleyin.
- 10 μL hücre süspansiyonu alın ve 90 μL tampon ekleyerek 10x seyreltme yapın. Seyreltilmiş hücre süspansiyonundan 10 μL alın ve hücre sayımı için 10 μL tripan mavisi ile karıştırın. Canlı hücrelerin verimini belirlemek için bir hemositometredeki hücreleri sayın.
- Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Hücreleri 107 hücre başına 90 μL tamponda yeniden süspanse edin. 10 7 hücre başına 10 μL manyetikCD4 mikro boncuk ekleyin. Hücreleri 4 ° C'de 15 dakika inkübe edin. En iyi sonuçlar için, inkübasyon sırasında hücre süspansiyonunu her 5 dakikada bir hafifçe karıştırın.
- Hücreler inkübe edilirken, manyetik standın üzerine bir ayırma sütunu yerleştirin. Kolonu 2 mL tampon ile önceden ıslatın.
- Hücre / boncuk inkübasyonunun sonunda, hücreleri 5 mL tampon ile yıkayın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin.
- Hücreleri 1 mL tamponda yeniden süspanse edin, numuneyi hücre ayırma kolonuna yükleyin ve akmasına izin verin. CD4 hücre fraksiyonunu toplamak için 15 mL'lik bir santrifüj tüpü kullanın. Rezervuarı kurumadan yıkamak için 1 mL tampon ekleyin. Yıkama adımını 2 kez tekrarlayın.
- Hücre ayırma kolonunu manyetik standdan çıkarın ve yeni bir 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. Hücre ayırma kolonuna 2 mL hücre izolasyon tamponu ekleyin ve hücreleri kolondan dışarı itmek için pistonu sıkıca uygulayın.
- CD4 + hücreleri elde etmek için fraksiyonu 350 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
>4. Naif CD4+ T hücrelerinin (CD4 + CD25-CD44loCD62Lhi) Floresanla aktive Edilen Hücre Sıralama ve TH GM farklılaşması ile saflaştırılması
- Elde edilen CD4 + hücre peletini 500 μL tampon içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri, CD4-PerCp (2.8 μg/mL), CD44-APC (2.4 μg/mL), CD25-PE (2 μg/mL) ve CD62L-FITC (10 μg/mL) içeren floresan konjuge antikor karışımı ile karıştırın (Tablo 1). Hücreleri ışıktan koruyarak 20-30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
not: Antikorların konsantrasyonları daha önce laboratuvarda optimize edildi. Listelenen antikor sayısı 1-2 fareden alınan hücreler içindir.
- İnkübasyondan sonra, hücreleri 5 mL tampon ile yıkayın ve hücreleri 350 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve hücreleri 500 μL tamponda yeniden süspanse edin. Naylon bir ağ kullanarak hücreleri tekrar süzün.
- Hücre sıralaması için hücre süspansiyonunu bir FACS tüpüne aktarın. Toplama FACS tüplerini 500 μL tampon ile önceden kaplayın.
- FACS sıralaması ile bir CD4 + CD25-CD44loCD62Lyüksek popülasyonu (saf CD4 + T hücreleri) elde edin. Önce CD4 + CD25- 'i açın ve ardından bu popülasyondan CD44loCD62Lhi hücrelerini seçin.
- Saf CD4 + T hücresi fraksiyonlarını yeni bir 15 mL'lik santrifüj tüpüne toplayın. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
- Naif CD4 + T hücrelerini, 50 μM β-merkaptoetanol içeren tam RPMI ortamında 106 hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspanse edin.
- 48 oyuklu plakada ön kaplama için kullanılan anti-CD3e antikorlarını aspire edin. Her kuyucukta 0.25 milyon (250 μL) hücreyi IL-7 (2 ng/mL), anti-CD28 (1 μg/mL) ve anti-IFNγ (10 μg/mL) ile tohumlayın (Tablo 1).
not: Sitokin ve antikor konsantrasyonları daha önce laboratuvarda bir THGM hücre farklılaşması için optimize edildi.
- Hücreleri 3 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin. Kuluçka sırasında ortamı değiştirmeyin.
5. İn Vitro Üretilen Fare THGM Hücrelerinin Analizi
- Bir mikroskop kullanarak, farklılaşmadan 3 gün sonra hücre farklılaşmasını kontrol edin. Hücreleri hasat edin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 350 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri tam RPMI ortamıyla 2 kez yıkayın.
not: Diferansiye hücreler boyut olarak naif CD4+ T hücrelerinden daha büyüktür.
- Hücreleri 1 mL tam RPMI ortamında yeniden süspanse edin. 10 μL hücre süspansiyonu alın ve bir hemositometre ile hücre sayısını belirlemek için 10 μL tripan mavisi ile iyice karıştırın. Farklılaşmış hücreleri yeniden uyarma ve analiz için üç iksire bölün.
not: Hücre içi sitokin boyama ≥0.5 milyon hücre gerektirir.
- Hücre içi sitokin boyama için, hücreleri bir protein taşıma inhibitörü (1 μL/mL) varlığında forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) (100 ng/mL) ve iyonomisin (1 μg/mL) ile yeniden uyarın.
- Hücreleri toplayın ve 30 dakika boyunca anti-CD4 antikoru (PerCP konjuge, 0.2 mg / mL, 1:100 seyreltme; veya FITC konjuge, 0.5 mg / mL, 1:100 seyreltme) ile boyayın.
- Hücreleri 20-60 dakika boyunca 200 μL fiksasyon tamponu ile sabitleyin. Fiksasyondan sonra, hücreleri 2x 1 mL geçirgenlik tamponu ile yıkayın.
- GM-CSF'ye (PE konjuge, 0.2 mg / mL, 1:100 seyreltme), IL-17A'ya (FITC konjuge, 0.5 mg / mL, 1:100 seyreltme; APC konjuge, 0.2 mg / mL, 1:100 seyreltme), IL-4 (APC konjuge, 0.2 mg / mL, 1:100 seyreltme) ve IFNγ (APC konjuge, 0.2 mg / mL, 1:100 seyreltme; PE konjuge, 0.2 mg / mL, 1:100 seyreltme) karanlıkta 30 dakika.
Tablo 1: Kullanılan sitokinler ve antikorlar.
| ad | Stok konsantrasyonu | Çalışma konsantrasyonu | Seyreltme | 500 μL boyama tamponundaki hacim |
| CD4-PerCp | 0.2 mg / mL | 2,8 μg/mL | 1:71 | 7 μL |
| CD44-APC (Hassas Sertifika) | 0.2 mg / mL | 2,4 μg/mL | 1:83 | 6 μL |
| CD25-PE | 0.2 mg / mL | 2 μg/mL | 1:100 | 5 μL |
| CD62L-FITC | 0.5 mg / mL | 10 μg/mL | 1:50 | 10 μL |
| GM-CSF-PE | 0.2 mg / mL | 2 μg/mL | 1:100 | |
| IL-17A-FİTC | 0.5 mg / mL | 5 μg/mL | 1:100 | |
| IL-17A-APC | 0.2 mg / mL | 2 μg/mL | 1:100 | |
| IFNγ-APC | 0.2 mg / mL | 2 μg/mL | 1:100 | |
| IFNγ-PE | 0.2 mg / mL | 2 μg/mL | 1:100 | |
| IL-4-APC | 0.2 mg / mL | 2 μg/mL | 1:100 | |
| CD4-FITC | 0.5 mg / mL | 5 μg/mL | 1:100 | |
| IL-7 | 20 μg/mL | 2 ng/mL | 1:10000 | |
| Anti-CD28 | 0.5 mg / mL | 1 μg/mL | 1:500 | |
| Anti-IFNγ | 1 mg / mL | 10 μg/mL | 1:100 | |