Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Beyin ayrışması ve manyetik mikroglial izolasyon
>NOT: Tüm hücre manipülasyonları ve yeniden süspansiyonları 1.000 μL'lik bir pipetle büyük bir dikkatle yapılmalıdır. Yüksek bir mekanik etki uygulamak, mikroglia hücrelerini aktive edebilir veya öldürebilir.
- Tablo 1'e göre ayrışma karışımı içeren ayrışma tüpü başına 12 beyin parçası (~ 1.2 g) aktarın. 24 yavru için dört C-Tüpüne ihtiyaç duyulacaktır (Şekil 1A-B).
- C-Tüpleri ayırıcıya yerleştirin (ısıtma modu ile). Ekipmanda optimize edilmiş NTDK programını üreticinin talimatlarına göre başlatın (Şekil 1D).
- Tüm hücreleri toplamak için 20 saniye boyunca (4 ° C'de) 300 x g'da santrifüjleyin. 1.000 μL'lik bir pipetle üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek mekanik ayrışmayı tamamlayın (Şekil 1E).
- Hücreleri dört adet 15 mL'lik tüp + süzgeçlere aktarın. Süzgeçleri 10 mL 1x Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile Ca2+ ve Mg2+ (HBSS+/+) ile durulayın (Şekil 1F).
- 300 x g'da 10 dakika (4 °C'de) santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Peleti 10 mL HBSS+/+ ile dikkatlice yeniden süspanse edin (Şekil 1G).
- 300 x g'da 10 dakika (4 °C'de) santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Peleti 6 mL ayırma tamponu (1x PBS +% 0.5 BSA) ile dikkatlice yeniden süspanse edin (Şekil 1H).
- 300 x g'da 10 dakika (4 °C'de) santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Tüp başına 200 μL CD11b-mikroboncuk çözeltisi ekleyin ve dikkatlice yeniden süspanse edin (Şekil 1I).
- Tüpleri 4 ° C'de 15-20 dakika inkübe edin. Peletleri 6 mL ayırma tamponu ile dikkatlice yeniden süspanse edin (Şekil 1I-J).
- 300 x g'da 10 dakika (4 °C'de) santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Peleti 8 mL ayırma tamponu ile dikkatlice yeniden süspanse edin (Şekil 1K).
- Sekiz sütun hazırlamak için ayırıcı üzerindeki POSSEL programını izleyin (Malzeme Tablosuna bakın). Kolondaki hücreleri 1 mL'ye 1 mL'lik transfer edin. Başka bir mL eklemeden önce tüm hücrelerin geçmesini bekleyin. CD11b+ hücrelerini, 1 mL ayırma tamponu ile steril bir elüsyon plakası üzerinde elute edin (Şekil 1L).
- CD11b + hücrelerini 50 mL'lik yeni bir tüpte toplayın (Şekil 1M).
- 300 x g'da 10 dakika (4 °C'de) santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Peletleri 10 mL soğuk mikroglia ortamı (makrofaj serumsuz kültür ortamı (SFM) +% 1 Penisilin-Streptomisin (P / S)) ile dikkatlice yeniden süspanse edin (Şekil 1N).
- CD11b+ hücrelerini sayın. P8'de, beyin başına ~ 650.000 hücre elde edilmelidir.
not: Mevcut protokolde, hücreler otomatik bir hücre sayacı kullanılarak sayılmıştır (bkz. Malzeme Tablosu).
- Hücreleri soğuk mikroglia ortamında 650.000-700.000 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin ve hücre kültürü plakalarında dağıtın.
not: 6 oyuklu plakalar Western Blot içindir (kuyu başına 2 mL); 12 oyuklu plakalar RT-qPCR analizi içindir (kuyucuk başına 1 mL) ve 96 oyuklu plakalar fagositik tahlil içindir (kuyucuk başına 250 μL).
>Tablo 1: Ayrışma karışımının hazırlanması.
Adet
Adet
Adet
| çözüm | Bir C-Tüpü (μL) için | Dört C-tüpü için (μL) |
| Tampon X | 2850 | 11400 |
| Enzim P (Papain) | 75 | 300 |
| Enzim A (DNAse) | 15 | 60 |
| Tampon Y | 30 | 120 |
| toplam | 2970 | 11880 |
