Mikroglia'nın Fare Yavrusu Beyinlerinden Manyetik İzolasyonu

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Beyin ayrışması ve manyetik mikroglial izolasyon

>NOT: Tüm hücre manipülasyonları ve yeniden süspansiyonları 1.000 μL'lik bir pipetle büyük bir dikkatle yapılmalıdır. Yüksek bir mekanik etki uygulamak, mikroglia hücrelerini aktive edebilir veya öldürebilir.

1. Tablo 1'e göre ayrışma karışımı içeren ayrışma tüpü başına 12 beyin parçası (~ 1.2 g) aktarın. 24 yavru için dört C-Tüpüne ihtiyaç duyulacaktır (Şekil 1A-B).
2. C-Tüpleri ayırıcıya yerleştirin (ısıtma modu ile). Ekipmanda optimize edilmiş NTDK programını üreticinin talimatlarına göre başlatın (Şekil 1D).
3. Tüm hücreleri toplamak için 20 saniye boyunca (4 ° C'de) 300 x g'da santrifüjleyin. 1.000 μL'lik bir pipetle üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek mekanik ayrışmayı tamamlayın (Şekil 1E).
4. Hücreleri dört adet 15 mL'lik tüp + süzgeçlere aktarın. Süzgeçleri 10 mL 1x Hanks' Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ile Ca²⁺ ve Mg²⁺ (HBSS+/+) ile durulayın (Şekil 1F).
5. 300 x g'da 10 dakika (4 °C'de) santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Peleti 10 mL HBSS+/+ ile dikkatlice yeniden süspanse edin (Şekil 1G).
6. 300 x g'da 10 dakika (4 °C'de) santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Peleti 6 mL ayırma tamponu (1x PBS +% 0.5 BSA) ile dikkatlice yeniden süspanse edin (Şekil 1H).
7. 300 x g'da 10 dakika (4 °C'de) santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Tüp başına 200 μL CD11b-mikroboncuk çözeltisi ekleyin ve dikkatlice yeniden süspanse edin (Şekil 1I).
8. Tüpleri 4 ° C'de 15-20 dakika inkübe edin. Peletleri 6 mL ayırma tamponu ile dikkatlice yeniden süspanse edin (Şekil 1I-J).
9. 300 x g'da 10 dakika (4 °C'de) santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Peleti 8 mL ayırma tamponu ile dikkatlice yeniden süspanse edin (Şekil 1K).
10. Sekiz sütun hazırlamak için ayırıcı üzerindeki POSSEL programını izleyin (Malzeme Tablosuna bakın). Kolondaki hücreleri 1 mL'ye 1 mL'lik transfer edin. Başka bir mL eklemeden önce tüm hücrelerin geçmesini bekleyin. CD11b+ hücrelerini, 1 mL ayırma tamponu ile steril bir elüsyon plakası üzerinde elute edin (Şekil 1L).
11. CD11b + hücrelerini 50 mL'lik yeni bir tüpte toplayın (Şekil 1M).
12. 300 x g'da 10 dakika (4 °C'de) santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Peletleri 10 mL soğuk mikroglia ortamı (makrofaj serumsuz kültür ortamı (SFM) +% 1 Penisilin-Streptomisin (P / S)) ile dikkatlice yeniden süspanse edin (Şekil 1N).
13. CD11b+ hücrelerini sayın. P8'de, beyin başına ~ 650.000 hücre elde edilmelidir.
    not: Mevcut protokolde, hücreler otomatik bir hücre sayacı kullanılarak sayılmıştır (bkz. Malzeme Tablosu).
14. Hücreleri soğuk mikroglia ortamında 650.000-700.000 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin ve hücre kültürü plakalarında dağıtın.
    not: 6 oyuklu plakalar Western Blot içindir (kuyu başına 2 mL); 12 oyuklu plakalar RT-qPCR analizi içindir (kuyucuk başına 1 mL) ve 96 oyuklu plakalar fagositik tahlil içindir (kuyucuk başına 250 μL).

>Tablo 1: Ayrışma karışımının hazırlanması.

Şekil 1: Beyin ayrışmalarının ve mikroglial hücrelerin izolasyonunun şematik gösterimi. (A-C) P8 fare beyni diseksiyonu ve koku alma ampulleri ile beyincik çıkarıldıktan sonra, beyinler önce HBSS+/+ içeren bir Petri kabına, daha sonra da ayrışma karışımını içeren ayrışma tüplerine aktarıldı. C-tüpleri ayrıştırıcıya yerleştirildi (ısıtma modu ile) ve NTDK programı başlatıldı (D). (E) Programın sonunda, tüpler 4 ° C'de 20 saniye boyunca 300 x g'da santrifüjlendi; ayrışma daha sonra 1.000 μL'lik bir pipet ile üç kez yukarı ve aşağı pipetlenerek tamamlandı. (F) Hücreler daha sonra 15 mL tüplere + 70 μm'lik süzgeçlere aktarıldı ve 10 mL HBSS +/+ ile durulandı. (G) Numuneler daha sonra 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjlendi, süpernatant çıkarıldı ve pelet 10 mL HBSS + / + ile yeniden süspanse edildi. (H) Tüpler tekrar 300 x g'da 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjlendi; süpernatan çıkarıldı ve daha sonra pelet 6 mL ayırma tamponu içinde yeniden süspanse edildi. (I) Tüpler 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjlendi, süpernatant çıkarıldı ve CD11b-mikroboncuk (200 μL) çözeltisi eklendi. Tüpler 4 ° C'de 15-20 dakika inkübe edildi ve daha sonra 6 mL ayırma tamponu (J) içinde yeniden süspanse edildi ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjlendi. (K) Süpernatan çıkarıldı ve pelet, 8 mL ayırma tamponunda dikkatlice yeniden süspanse edildi. (L) Ardından, sütunları hazırlamak için ayırıcı üzerinde POSSEL programını başlatın. Hücreler kolon üzerinde 1 mL'ye 1 mL transfer edildi ve CD11b hücreleri, 1 mL ayırma tamponu ile steril bir elüsyon plakası üzerinde ayrıştırıldı. (M) CD11b hücreleri yeni bir 50 mL tüpte toplandı ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjlendi ve süpernatan çıkarıldı. (N) Pelet, son adımda 10 mL soğuk mikroglia ortamında dikkatlice yeniden süspanse edildi. Hücreler sayıldı ve mikroglial ortamda, hücre kültürü plakalarında dağıtılan 650.000-700.000 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyona