Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Rekombinant DNA ve Protein Kompleksleri Görselleştirme

Summary

Plazmid DNA, sitoplazmik proteinleri ve DNA-protein kompleksleri görselleştirme dokunarak modu için bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem, biyokimyasal manipülasyon AFM görüntüleme örnekleri hazırlamak için alternatif yaklaşımlar içerir. Spesifik protein etkileşim bölgeleri içeren DNA yakın fizyolojik tampon koşulları görülmektedir.

Abstract

Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), bireysel protein, DNA molekülleri, protein-protein kompleksleri, ve DNA-protein kompleksleri görselleştirmek için sağlar. Nanometreden mikrometre arasında değişen traversler görüntü alanlarında, herhangi bir noktada substrat yüzeyinde dinlenme makromoleküllerin yükseklik ölçme nano ölçekli bir prob, mikroskop konsol ucunda. Elektrostatik kuvvetler gevşek rastgele yönlerde yüzeye tutunur ve görüntüleme izni, proteinler, lipidler, ve nükleik asitlerin neden olur. Oluşturulan veriler, makromoleküllerin üç boyutlu parçacıklar ayrık boyutları (Şekil ¹⁾ 1,2 olarak çözmek bir topografik harita, benzerler . Vurma modunda AFM, DNA ve proteinler gibi nispeten yumuşak biyomalzemeler görüntüleme izin konsol tekrarlanan bir salınım içerir. AFM diğer nano ölçekli mikroskopi teknikleri üzerinde kayda değer faydalar bireysel yakın fizyolojik tamponlu koşulları dahil olmak üzere gerçek-zamanlı olarak, boyama veya kaplama yansıması için örnek olmadan sulu tamponlar, proteinler ve makromoleküler kompleksleri görselleştirmek için göreceli bir adaptasyon.

Burada sunulan DNA ve çözüm tamponlu bir immunoadsorbed transkripsiyon faktörü (yani glukokortikoid reseptör, GR) (Şekil 2) görüntüleme yöntemi açıklamaktadır. Immunoadsorbed proteinler ve protein kompleksleri antikor epitop ve sonra görüntülü (Şekil 2A) ile rekabet immunoadsorbing antikor-boncuk pelet ayrılabilir. Bu görüntüleme için önce ilgi biyomoleküllerin biyokimyasal manipülasyon için izin verir. Bir kere, saflaştırılmış DNA ve proteinler karışık olabilir ve ortaya çıkan etkileşim kompleksi de görüntülü olabilir. Mika DNA bağlayıcı Ni ² gibi ^3, kalsiyum katyon gerektirir ⁺ veya Mg ^{2 +,} protein aktivitesi korumak henüz örnek tamponlar eklenebilir. Benzer bir yaklaşım kullanarak AFM, bireysel DNA ipliklerini bağlı RNA ^{polimeraz 4} ve onarım ^{enzimi 5,} de dahil olmak üzere bireysel enzimler, görselleştirmek için kullanılmıştır. Bu deneyler, protein-protein ve DNA-protein biyofiziksel etkileşimlerin moleküler düzeyde yer alan önemli bir içgörü sağlar. AFM Görüntüleme bireysel makromoleküler parçacıklar, parçacık homojenlik belirlemek için ve görüntülü parçacıkları oluşturan bileşenlerin fiziksel olarak düzenleme belirlemek için yararlı olabilir. Bu yöntem GR bağlayabilirsiniz GR-hastabakıcı protein kompleksleri ^1,2 ve DNA ipliklerini görünüm için geliştirilen iken, çeşitli kaynaklardan görüntüleme DNA ve protein örneklerinin geniş uygulanan olabilir.

Protocol

1. Yabancı maddelerden arındırılmış yansıması DNA ve protein örneklerinin hazırlanması

1. Görüntülü ve yer olarak uygun bir sulu tampon biyomoleküllerin izole edin. Görüntülenecek Proteinler kullanarak saflaştırılmış sıvı kromatografi ⁶ olabilir, immunoadsorption antikor ve pelet ^1,2 kaldırılması, ya da Profinity tam bir arınma ve etiketini ^çıkarma 7 (Şekil 2A) izledi . Miniprep arıtma (Şekil 2B) tarafından görüntülendi DNA molekülleri izole edin.
2. SDS-PAGE ve western blot kullanarak görüntülü protein örneklerinin bileşimi ve saflığı onaylayın. DNA dizisi ve saflık bir kısıtlama sindirmek ve agaroz jel elektroforezi tamamlayarak onaylayın.
3. Mika için numune bağlılığı teşvik etmek için bir AFM adsorpsiyon tampon örnekler inkübe edin. Protein örnekleri için, 10 mM HEPES tamponu kullanılıyor olabilir. Ek düşük iyonik kuvvet tuzları veya diğer kofaktör de eklenebilir. DNA örnekleri, kalsiyum katyon (örneğin Mg ^{2 +} veya Ni ^{2 +)} mika yüzeye adsorbsiyon teşvik etmek. DNA için uygun Mg ^{2 +} içeren tampon 10 mM Tris, pH 7.5, 10 mM NaCl, 2 mM MgCl ₂ ^3. Alternatif bir Ni ^{2 +} tampon, 10 mM Hepes, pH 6.8, 10 mM _NiCl 2 .
4. Adsorpsiyon tampon 5 mg / ml 'lik bir konsantrasyon için örnek seyreltilir. Hafifçe karıştırın. Mikroskop hazırlanan edilirken buz üzerinde saklayın.

2. Montaj AFM prob

1. Sıvı hücre prob tutucu ilgili konsol yükleme yerleştirme istasyonu üzerine yerleştirin.
2. Görüntüleme için kullanılan keskin nitrür kolunu (SNL) prob uzun, kalın konsol ('B' konsol olarak anılacaktır) bulun. Dikkatle ucu dik kalmasını sağlayarak, sıvı hücre prob tutucu transfer. Teknik not: prob transit ise Extreme bakımı, herhangi bir yükseklikte bırakarak olarak ödenmelidir konsol veya ucu zarar veya zarar verebilir. Microlever SNL (MSNL) prob SNL prob alternatif olarak kullanılıyor olabilir.
3. Yerleştirme istasyonu prob tutucu çıkarın ve konsol sağlam ve düzgün bir şekilde sıvı hücre prob tutucu oturduğundan emin olmak için bir ışık mikroskop altında incelenmesi.
4. Dikkatle tırtıllı kafa vidalı kelepçe sıkma aleti dovetail montaj AFM baş kaldırmak. Teknik not: AFM baş işlenirken çok titizlikle, hatta kısa bir mesafe (kurtağzı montaj doğru şekilde oturduğundan değilse örneğin) bırakarak, ödenmesi gereken önemli hasara neden olabilir.
5. AFM başını ters çevirin ve dört iğne üzerine sıvı hücre prob tutucu AFM kafa tabanına sıkıca itin. AFM kafası alet dovetail montaj içine dikkatlice dönün. Cihazın içine AFM baş tutturmak için tırtıllı kafa vidalı kelepçe bırakın.

3. Konsol ucu Konumlandırılması lazer hizalama ve fotodetektör ayarlayarak

1. AFM enstrüman yazılımı kullanarak, onboard ışık mikroskobu kollarını hareket ettirerek konsol ucu bulun. Gerekirse uç kimlik geliştirmek için mikroskop aydınlatma ayarlayın. Cihaz yazılımı görüntülenen crosshair'i yakın içine konsol ucu sonuna getirin.
2. Konsol ucu yazılım optik kontrol yukarı ve aşağı okları ayarlayarak odak noktası haline getirin. Optik ayarlama, yavaş (S) veya orta (M) hız kullanın.
3. Lazer, lazer ayarlama düğmeleri kullanarak konsol ucu aynı hizaya getirin. Kırmızı lazer nokta, beyaz aydınlatma spot içinde ayar düğmeleri kadar hareket ettirin. Lazer konsol ucu üzerine getirilinceye kadar zig-zag desen kullanarak konsol kol boyunca iz. Düzgün hizalanmış, güçlü bir yansıması nokta AFM başın ön penceresinde görünecektir.
4. Merkezi AFM kafasına fotodetektör düğmeleri ayarlayarak fotodetektör. Bu cihaz yazılım fotodetektör ekran crosshair'i lazer nokta uyumlu hale getirecektir. Gözlenen sinyal toplamı yaklaşık 4-6 olmalıdır.

4. Konumlandırma AFM baş ve ayar konsol

1. AFM tutucu plakası tepesinde manyetize numune tutucu bir metal AFM örnek diske bağlı mika taze bölünmüş bir yaprak yerleştirin. Bu kurulum öncesinde görüntüleme Adım 1 hazırlanan DNA veya protein örnek AFM kafa pozisyonu kullanılacaktır.
   1. Teknik not: manyetize olan numune tutucu ve sıvı hücre prob tutucu, mekanizmalar ve prob sahipleri tespit diğer örnek daha kalındır. Mika-numune tutucu montaj ve AFM kafa arasında yeterli boşluk varsa, cihaz yazılımı birkaç kez çekilme simgesini seçerek AFM başını yukarı hareket ettirin.
2. Örnek disk ilk görüntüleme için konumlandırılmış böylece AFM tutucu plakası döndürün. Mika substrat AFM başlık altında merkezli olduğundan emin olun.
3. Doğru AFM baş aşağı hareket ettirincihaz yazılım odak yüzey kontrolü kullanarak mika örnek disk yüzeyi. Z motor orta (M) hızını seçin ve yüzeye doğru devam AFM baş mika üzerinde yaklaşık 2 mm kadar. Şu anda, prob ve yüzey (ucu çökmesini olarak anılacaktır) arasında ani temastan kaçınmak için yavaş (S) Z motor hızı kullanarak geçin.
4. Mika yüzey veya ucu yansıması farklı özellikler Odak kadar prob mika substrat yüzeyine yakın taşımak için devam edin. Cihazın yazılımı simgesi: yüzey ve "odak noktası" kullanarak ucu yansıması odak düzlemleri arasında geçiş.
5. Cihazın yazılımı ayar simgesini seçin ve konsol ayarlamak. Önerilir SNL ve MSNL konsol probları rezonans frekansı 20-60 kHz. Ofset% 5 tepe seçin. Teknik not: Yeterli konsol ayarı yeterli örnek görüntüleme için çok önemlidir.

5. Görüntüleme mika örnek yüzey

1. Mika yüzeye prob meşgul. İlk tarama boyutu 10 mm ve 1 Hz tarama hızı ayarlayın. İntegral kazanç ve oransal kazanç başlangıçta sırasıyla 0.2 ve 0.4 olarak ayarlanmış olabilir. Iz var ve tekrarlanırken taramaları kabaca örtüştüğü için gerektiği gibi kazanımlar ayarlayın. Genlik set azaltılması, sonda ve mika arasındaki etkileşimi artırmak ve katılımı sağlamak.
2. 10 mikron alanında tam bir tarama görüntüler yakalayın. 1, büyüklükleri 5 ila tarama, ve 0.5 mikron ve her bir alanın tam görüntü yakalamak azaltın. Gerekli kazanç ve tarama hızı ayarlayın. Mika yüzey görüntülerini yakalama, DNA ve protein içeren örnekler için karşılaştırma için bir temel sağlar.
3. Cihazın yazılımı boşa simgesine tek bir tıklama ile prob ayırın.

6. Görüntüleme biyomoleküllerin

1. Adım 1 hazırlanan DNA veya protein örnek hafifçe karıştırın ve görüntülü mika yüzeye yüklemek için hazırlamak. Taze adsorpsiyon tampon 45 ul (son örnek konsantrasyon = 0.5 mg / ml) ile hazırlanan örnek 5 ul karıştırın.
2. Mika yüzeye direkt olarak 0.5 mikrogram / ml biyomolekülün içeren bir çözüm dikkatlice 50 ul ekleyin. Bu prob veya AFM kafa hareket ettirmeden yapın ve örnek çözümü sağlamak (ancak pipetlemeyin ucu) prob ile temas yapar.
3. Pause 5 dakika örnek biyomoleküllerin mika yüzey uymak için izin vermek.
4. 5 dakika, pipetlemeyin sıvı hücre prob tutucu içine adsorpsiyon tampon ek 50-100 ul bitiminde prob AFM başkanı veya pipetlemeyin ucu ile mika dokunmayın dikkatli olmak. Bu formu ve bir menisküs AFM sıvı dokunarak modu görüntüleme için izin. Şekil 3 sıvı hücre, konsol, örnek, numune tutucu ve menisküs son düzenleme gösterir.
5. Fotodetektör yeniden ayarlayınız ve gerekli olarak konsol için lazer yeniden hizalayın. Teknik not: prob ucu ve lazer hizalama incelemekte prob tutucu örnek tampon ekleyerek kaynaklanan kırınım nedeniyle karmaşıktır. Elle gerekirse, konsol retune.
6. Cihazın yazılımını kullanarak prob yeniden meşgul. Dikey saptırma, integral kazanç ve gerektiğinde oransal kazanç ayarlayın. Bu mika bölümü hemen önce örnek ve yakalama görüntüleri ekleyerek taranan yeniden görüntüleme süreci başlayacaktır.
7. Ilgi alanları tanımlamak için (500 nm-10 mikron) tarama boyutu artırın. Zoom-in ve görüntü çözünürlüğü artırmak için 0.5 Hz tarama hızı azaltmak
8. Görüntüleme tamamlandıktan sonra, cihaz yazılımı simgesini çekilme birkaç kez seçilmesi prob boşa. AFM demontaj sıvı hücre veya numune disk önce baş ve örnek disk arasında yeterli mesafe olun.
9. Iyice artık adsorpsiyon tampon buharlaşır olarak oluşan tuz kristalleri önlemek için, saf su ile sıvı hücre prob tutucu ve örnek disk durulayın. Basınçlı hava ile kurutun.

7. Temsilcisi Sonuçlar:

AFM görüntüleri örnek olarak Şekil 4'te sunulmaktadır . Mika substrat (A) DNA ve protein adsorbe hangi üzerine moleküler düz bir yüzey sağlar. Görüntüleme mika önce biyomolekülün örnekleri görüntüleme gürültü bir negatif kontrol ve değerlendirme sağlar. Ayrıca konsol düzgün bir şekilde ayarlanmıştır ve sonraki örnek görüntüleme başarılı olacağına güvence düzeyi sağlar. Çift iplikli plazmid DNA (B, D), varsayımsal olarak supercoiled, asimetrik görünüm ve üniforma önceden normaldi mika substrat üzerine yatırılması ile kolayca tanımlanır. Sağduyulu parçacık boyutları (C, E) Protein kompleksleri de mika substrat benzersiz ayırt edilebilir. Partikül büyüklüğü farklılıkları örnek heterojenite gösterir ve protein kompleksi stokiyometri veya biyokimyasal aktivite yaklaştırmak için yararlı olabilir. Yanlısı genel çapraz şekli ve tutarlı bir yönelimPanel C görülen protein parçacıkları, proteinler expectedly mika substrat üzerinde rastgele bir moda odaklı olduğu gibi bir görüntüleme eserdir. Gözlenen artifakı Olası nedenleri fiziksel bir ucu anormalliği ya da çok hızlı bir tarama hızı AFM görüntüleme. Ucu konvolüsyon (Şekil 1B gösterilen) mutlak uzunluk ölçü hesaplamaları engellerken, x ve y eksenleri, yükseklik ölçümü (z ekseni) ve bağıl x ve y değerleri görüntülü biyomoleküllerin biyofiziksel özellikleri tahmin etmek için yine de faydalı olabilir.

Şekil 1: modu atomik kuvvet mikroskobu (AFM) vurma şematik sunumu. A, mikroskop. Konsol, sonunda mika substratın yüzey üzerinde tarar gibi dolaşacaktır ve aşağı keskin bir ucu biyomoleküler kompleksleri emilir. Tarayıcı x ve y doğrultularında hareket ettikçe, bir lazer ışını, üzerine oturtulmuş biyomoleküler kompleksleri üzerinden geçerken ucu hareket dikey (z) mesafe harita bir pozisyon duyarlı fotodiyot dedektörü üzerine konsol arka yansır mika. B. ucu konvolüsyon neden x ve y yönlerinde görüntü Distorsiyon. Geleneksel silisyum nitrür ucu nominal yarıçapı Görüntülenecek parçacıklar daha büyük, ve ucu temas örnek kenarından yüzeye erişir. İpucu konvolüsyon görüntülü x ve y yönünde daha büyük görünmesini zerrelerden değil z yönünde sonuçlanır. Bu etki, küçük bir nominal uç yarıçaplı ipuçları kullanımı minimize edilebilir.

Şekil 2: İllüstrasyon immunoadsorbed protein ve DNA numune hazırlama. Immunoadsorbed GR A, Yayın monoklonal antikor (mAb) protein A-sepharose (PAS) pelet • hsp70 protein kompleksi. MAb epitopu içeren bir peptid ile immunopellet kuluçka karmaşık supernatant ve AFM tarafından görüntülenmiştir alınacak izin, pelet GR • hsp70 protein kompleksi serbest kolaylaştıracaktır. B, AFM görüntüleme için DNA hazırlanması, kalsiyum katyon adsorpsiyon tampon kullanımını gerektirir. Kalsiyum katyonu mika substrat için DNA yakınlığı artar.

Şekil 3: AFM baş, sıvı hücre prob tutucu, örnek, numune tutucu ve tampon menisküs Final düzenleme. A, Bakım, mika yüzey üzerine pipetlemeyin ucu ve AFM baş, sıvı arama, ve mika yüzeyler arasındaki fiziksel temas önlemek için örnek ve ek tampon yatırma alınmalıdır. B, A. tampon menisküs sıvı hücre prob tutucu örnek diskten yayılan Büyütme.

Şekil 4: mika substrat Atomik kuvvet mikrograflar (A) tampon çözeltisi 2xGal4-2xGRE luciferease plazmid DNA ⁸ (B, D) ve GR • hsp70 protein kompleksleri (C, E). Mika, DNA ve protein görselleştirme ile karşılaştırmak için bir kontrol görüntü olarak hizmet vermektedir. GR • hsp70 protein kompleksleri ile astarlanmalıdır mAb rakip antikor (Şekil 2A gösterilen) ile antikor-boncuk pelet serbest hsp70 ve GR immunoadsorption tarafından hazırlanmıştır. DNA geleneksel plazmid miniprep tarafından hazırlanmıştır. Paneller A, B, ve C eşdeğer bir büyütme (ölçek bar = 200 nm), Paneller D ve E (ölçek bar = 40 nm).

Discussion

AFM, sulu ve yakın-fizyolojik tamponlu çözümleri gerçek zamanlı olarak görüntüleme bireysel kaplanmamış biyomoleküllerin yapabilen eşsiz bir mikroskopik tekniğe sağlar. Bu görünüm için bireysel proteinler ve DNA molekülleri, yanı sıra multiprotein kompleksleri ve protein-DNA kompleksleri izin verir. AFM ile Görüntüleme makromoleküler parçacıklar değerlendirmek için örnek homojenlik ve gözlenen parçacıkları oluşturan bileşenlerin fiziksel olarak düzenleme tanımlamak için yararlı olabilir. Bu yaklaşım, bireysel makromoleküler parçacıkları gözlemleyerek immunoprecipitation deneyleri, poliakrilamid jel elektroforezi ve faiz 10 ³ -10 ¹¹ ayrı biyomoleküler kompleksleri temsil eden önemli bir özetleyici veri sağlayan boyutu dışlanma kolon kromatografisi, gibi geleneksel biyokimyasal teknikleri, faydalı bir yardımcı olabilir bir örnek.

Multiprotein karmaşık stokiyometri, biyomoleküler etkileşimleri ve kofaktör gereksinimleri üzerinde yapılan araştırmalar, tüm AFM kullanılarak incelenmiştir olabilir. Burada sunulan yöntem, özel ilgi biyofiziksel soruları karşılamak için adapte edilebilir. Örneğin, tampon değişimi yapabilen bir sıvı hücre prob tutucu kullanarak, kofaktör gereksinimleri protein kompleksi oluşumu için tahlil etmek mümkün olabilir. Hatta yakın gerçek zamanlı ve görüntülü sırasında DNA-protein meclisleri kuruldu ve ayrışmış olabilir. Hipotez bağlayıcı protein ile karıştırılarak özel ilgi dizileri (olası bir yanıt elemanları veya yeni protein bağlayıcı dizisi gibi), DNA ve moleküller arası etkileşimlerin doğrudan kanıt görüntülü olabilir.

Kuru örnekleri numune sulu çözeltiler ve lineer DNA standları ve kapalı daire DNA plazmid bu şekilde ^3,9 imaged her ikisi de yerine kullanılmaktadır Vurma modunda AFM görüntüleme önemli ölçüde daha az karmaşık. Burada sunulan yöntem, daha fizyolojik bir görüntüleme ortamı sağlamak amacıyla tamponlu çözümler örnekleri kullanır. Diğer göze çarpan görüntüleme proteinlerin yöntemleri alanında kızılötesi mikroskopi ¹⁰ yakınlarındaki de dahil olmak üzere, göz önüne alınmalıdır. AFM ile sanatçılı immunoadsorption tamamlayıcı kullanımı köklü biyokimyasal teknikler kullanarak, sayısız protein kompleksleri hazırlamak için bir fırsat sağlar ve daha sonra tahliye immunoadsorbing antikor-boncuk pelet onları görselleştirmek. Örneğin, karmaşık bir boyut ve stoichiometries tahmin etmek için bu yaklaşım kullanarak immunoadsorbed ^GR 2 hsp70 moleküler şaperon ^protein 1 dynein motor proteinin yanı sıra, dernek için test edilmiştir . Partikül büyüklüğü ve biyofizik özellikleri (örneğin, katılık) AFM görüntülü örnekleri ^11,12 gözlenen biyomoleküllerin kimlik ascertaining yararlı olmuştur. Bu hedef biyomolekülün varsa, hedef ve neden bir tanecik boyutunu artırmak bağlamak istiyorsunuz etkileşim biyomolekülün (örneğin bir ligand veya monoklonal antikor), ek biyomolekülün kimliğini onaylamak için de mümkündür.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası
Boyut 3100	Bruker	Boyut 3100
Boyut Akışkan Hücresi	Bruker	DTFML-DD-HE
Keskin nitrür kolunu (SNL) silisyum nitrür AFM prob	Bruker	SNL-10
Microlever keskin nitrür kolu (MSNL) silisyum nitrür AFM prob	Bruker	MSNL-10
NanoScope AFM enstrüman yazılımı	Bruker	004-132-000
Metal AFM örnek diskler	Ted Pella	16208
Sınıf V1 Mika diskler, 12 mm	Ted Pella	50-12