$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Bakteriyel İnçikulaların Büyümesi ve Hazırlanması
- Helicobacter pylori (H. pylori) veya H. felis'in gliserol stoklarını -80 °C'den itibaren çözdürün ve aşağıdakileri içeren at kanı agar (HBA) plakalarında alt kültür oluşturun: Kan Agar Baz No.2 (Malzeme Tablosuna bakınız); modifiye edilmiş bir "Skirrow'un antibiyotik seçici takviyesi" (vankomisin, 10 μg / mL; polimiksin B, 25 ng/mL; trimetoprim, 5 μg/mL; amfoterisin B, 2.5 μg/mL); ve% 5-10 (h / h) at kanı. Bakteriler, mikroaerobik koşullar altında, uygun gaz paketlerini içeren 2,5 veya 3,5 L anaerobik kavanozlarda (Malzeme Tablosuna bakınız), 37 °C'de
NOT: Bu koşullar altında yetiştirilen H. pylori suşları 1-1.5 günlük inkübasyondan sonra alt kültüre alınmalıdır, oysa H. felis için genellikle en az 2 günlük inkübasyon gereklidir. Uygun kültür ve depolama ortamı daha önce ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
- Erken-orta logaritmik faz kültürlerinden fare enfeksiyonu için bakteri aşısı hazırlayın. Her plakayı 1-2 mL beyin kalp infüzyonu (BHI) suyu ile doldurarak agar plakalarından bakterileri nazikçe hasat edin. Pasteur pipetleri ile plakalardan süspansiyonları aspire edin.
- Alternatif olarak, BHI suyunda 16-18 saat boyunca çoğaltılan Helicobacter bakterilerinden inokül hazırlayın. Bu durumda, 4 ° C'de 10 dakika boyunca 2.200 x g'da düşük hızlı santrifüjleme ile bakteri toplayın.
- Faz kontrast mikroskobu (100X objektif) altında ıslak montaj preparatlarını inceleyerek bakterilerin canlılığını ve hareketliliğini değerlendirin. Bir cam mikroskop lamı üzerinde 10-20 μL'lik bir BHI suyu damlasında bir döngü dolusu bakteriyi yeniden süspanse ederek ıslak montajlar hazırlayın. H. pylori'den çok daha büyük bir bakteri olan H. felis durumunda, canlı bakteri sayısını doğru bir şekilde saymak için bir hemositometre kullanın. Gram boyama yaparak kültür saflığını onaylayın.
not: H. pylori inocula'yı yalnızca bakterilerin çoğunluğu basiller veya spiral bir şekle sahipse kullanın (morfoloji suşa bağlı olarak değişebilir). H. felis inocula öncelikle sarmal şekilli bakteriler içermelidir.Çoğu bakteri kokoid morfolojisine sahipse inocula'yı kullanmayın, çünkü bu formlar uygun değildir ve farelerde bir enfeksiyon oluşturmaz.
- Faz kontrast mikroskobu altında alan başına yaklaşık bakteri sayısını (100X objektif) sayarak ve aşağıdaki kılavuzu kullanarak aşıdaki bakteri sayısını tahmin edin: Alan başına 1 bakteri = yaklaşık 106 koloni oluşturan birim (CFU) Helicobacter/mL; Alan başına 10 bakteri = yaklaşık 107 CFU/mL; Alan başına 100 bakteri = yaklaşık 108 CFU/mL, ve saire.
- Bir hemositometre kullanırken, aşağıdaki formülü kullanarak CFU / mL'yi hesaplayın:
CFU/mL = (4 x 4 alandaki ortalama bakteri sayısı) x (seyreltme faktörü) x (10,4).
- Gerekirse BHI suyunda seyrelterek inokulumun bakteri hücre yoğunluğunu yaklaşık 107-10 8 CFU / mL'ye ayarlayın.
- Maksimum bakteri canlılığını sağlamak için, hazırlandıktan sonra mümkün olan en kısa sürede intragastrik gavaj için inokül kullanın.
- Gavaj prosedüründen hemen sonra canlı inokül sayımı yaparak H. pylori hücre yoğunluğunu ve canlılığını daima onaylayın (aşağıya bakınız). Bu durum H. felis için her zaman mümkün değildir, çünkü H. felis genellikle kültür ortamında izole koloniler oluşturmaz. Aşılardaki canlı Helicobactersayıları tek başına optik yoğunluk ölçümü (A600) ile belirlenemez, çünkü bu yöntem canlı (yani basil/spiral/sarmal) ve canlı olmayan (yani kokoid) bakteriler arasında ayrım yapmaz.
- Aşıdaki canlı H. pylori bakterilerinin sayısını tahmin etmenin bir yolu olarak optik yoğunluk değerlerini kullanın, ancak bu durumda önce bir büyüme eğrisi oluşturmak gerekir. Bunun için, H. pylori kültürlerinin A600 değerleri zaman içinde izlenir ve plaka sayımı ile belirlenen canlı bakteri sayılarıyla doğrudan ilişkilendirilir.
not: Bu tür büyüme eğrisi belirlemelerini gerçekleştirmek için uygun bir yöntem, bakterileri sıvı bir ortamda (Bölüm 1.2), %10'luk bir CO2 inkübatöre yerleştirilmiş standart düz tabanlı doku kültürü şişeleri kullanarak kültürlemektir. 2-3 gün boyunca her 4-6 saatte bir elde edilen kültürlerin alikotlarından belirlenen CFU sayıları daha sonra karşılık gelen A600 değerleriyle karşılaştırılır. Daha da önemlisi, her H. pylori suşu için büyüme eğrileri oluşturulmalıdır, çünkü bunlar farklı oranlarda büyüyebilir ve ayrıca tüm suşlar% 10CO2'de iyi büyümez.
2. Helicobacter'li Farelerin İntragastrik Gavajı
>NOT: Bu intragastrik gavaj yöntemi, bağırsağı kolonize eden diğer bakteri türlerine uygulanabilir, örneğin S. Typhimurium, C. rodentium, Listeria monocytogenes.
- 6-8 haftalık, spesifik patojen içermeyen (SPF) ve Helicobacter içermeyen erkek veya dişi fareler kullanın. H. pylori veya H. felis ile enfeksiyon deneyleri için C57BL / 6 genetik geçmişine sahip hayvanları kullanın. Bu çalışmada, doğuştan gelen önemli bir bağışıklık reseptörü olmayan vahşi tip (WT) ve genetik olarak modifiye edilmiş C57BL / 6 fareleri kullandık (nakavt veya KO hayvanları olarak adlandırılır).
not: Diğer genetik geçmişe sahip fareler de Helicobacter enfeksiyonları için kullanılabilir, ancak kolonizasyon seviyeleri ve hastalık şiddeti, konakçı arka planının tipinden etkilenebilir.
- Bakteri aşısını (Adım 1.5) tek kullanımlık 1 mL'lik şırıngalara aspire edin ve verilen iğneleri, üzerine tek kullanımlık polietilen kateterlerin (uzunluk, 6-8 cm; iç çap, 0.58 mm) yapıştırıldığı 23 gauge iğne ile değiştirin. Küçük plastik film şeritleri uygulayarak kateterleri iğnelere sabitleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Alternatif olarak, iğne/kateter tertibatını steril plastik besleme tüpleri (20 gauge x 38 mm) kullanarak değiştirin.
- Boynun ve kuyruğun tırnağını sıkıca kavrayarak fareleri fiziksel olarak kısıtlayın.
not: Bu prosedür anestezi olmadan veya alternatif olarak metoksifluran veya izofluran gibi solunan bir anestezik kullanılarak gerçekleştirilebilir.
- Kateteri açık çenenin ortasına yerleştirin ve yemek borusuna doğru kaudal yönde yönlendirin. Yemek borusundan mideye erişim kolaylığı sağlamak için farenin boynunu (ve trakeadan uzağa), kateterin çoğu veya tamamı artık görünmeyene ve midenin tabanına karşılık gelen direnç hissedilene kadar uzatın. Genellikle aşılama başına 100 μL olan spesifik bir alikot verin (Şekil 1).
not: Optimal kolonizasyon ve hastalık patolojisini sağlamak için fareler ≥ 105 CFU ile gavajlanmalıdır.
