1. M. grisea Conidia Süspansiyonu ile Sprey Aşılama
- M.grisea için mantar kültürü
- Mantar suşları için yulaf ezmeli domates agar (OTA) kültür ortamını hazırlayın.
- 30 - 50 g yulaf ezmesini tartın, bunu 800 mL damıtılmış / deiyonize suya (ddH2O) ekleyin ve karışımı elektrikli tencerede 30 dakika kaynatın.
- Haşlanmış yulaf ezmesi suyunu bir parça gazlı bez ile behere süzün.
- Beherdeki süzüntüye 150 mL domates suyu ve 20 g agar ekleyin ve 1.000 mL'ye kadar ddH2O ekleyin.
- Deney materyallerinin hazırlanması
- Yaklaşık 50 pirinç tohumu (Oryza sativa) çeşidi Lijiangxintuan-heigu (LTH) ddH2O'da 3 gün bekletin veya yaklaşık 50 arpa tohumu (Hordeum vulgare cv Golden Promise) ddH2O'da yaklaşık 1 gün
bekletin.
- Pirinç veya arpa tohumlarını nemli gazlı beze sarın ve 28 ° C'de 10 cm x 10 cm çapında yaklaşık 30 Petri kabında nemli filtre kağıdına çimlendirin. Pirinç tohumu çimlenme süresi yaklaşık 2-3 gündür ve arpa tohumu çimlenme süresi yaklaşık 2 gündür. Seradaki bağıl nem yaklaşık% 70'tir.
- Pirinç veya arpa fidelerini otoklavlanmış saksı toprağı ve sulama kullanarak saksılara dikin ve ardından üzerlerini bir vermikülit tabakası ile örtün.
- Bitkileri yaklaşık 1 ~ 2 hafta boyunca 25 ° C'de uygun bir seraya veya büyütme kabinine yerleştirin.
- Steril cerrahi makasla (her dairenin çapı 8 cm olmalıdır) 3 kat filtre kağıdını daireler halinde kesin ve 100 mm steril plastik plakalara yerleştirin.
- Filtre kağıdını ıslatmak için her kaba ddH2O ekleyin.
- Filtre kağıdının tamamen ıslak olduğundan emin olun, ancak fazladan su eklemeyin.
- Bir vakum pompası ile fazla suyu alın.
- Pirinç / arpa yapraklarını desteklemek için kültür kabına 2 steril kürdan koyun; kürdanları ~ 2 - 3 cm aralıklarla yerleştirin.
- Tohumları ektikten 2 hafta sonra pirincin yapraklarını toplayın veya tohumları ektikten 7 gün sonra arpanın yapraklarını alın.
- 4 ila 6 yapraklı pirinç/arpa fideleri kullanarak, sapın alt kısmını üstten ~5 cm yükseklikte kesin ve yaprakları toplayın.
- Sprey aşılama protokolü
- OTA plakaları üzerindeki mantar türünü termostatik bir inkübatörde (25 ° C) ~ 4 gün boyunca kültürleyin.
- Her 4 günlük plakaya 0,5 - 5 mL'lik bir pipet kullanarak ~ 2 mL ddH2O ekleyin.
- Bir aşılama halkası ile, M. grisea vahşi tip suşunun misellerini ve mutant suşunu misel kalıntılarına kazıyın.
- Misel kalıntılarını toplayın ve yeni bir OTA plakasına aktarın. Misel kalıntılarını alın ve temiz tezgahta kurutun.
- Conidia'nın bir serada gündüz (14 saat) 25 °C'de ve gece (10 saat) 23 °C'de 24 - 48 saat boyunca büyümesi için gereken nemi sağlamak için plakayı 3 kat gazlı bezle örtün.
- Her tabağa 2 mL ddH2O ekleyin ve conidia'yı steril pamuklu çubuklarla nazikçe kazıyın ve ardından 2 kat lens kağıdından süzün. Kültür ortamının yüzeyini çizmemeye dikkat edin.
- Conidia süspansiyonunu 100 - 1.000 μL'lik bir pipet ile 50 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.
- 25 ° C'de minimum 5.000 x g'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın ve %0.025 (h/h) Tween-20 çözeltisinde mL başına 2 x 104 conidia verecek şekilde peleti yeniden süspanse edin. Tween-20 çözeltisi genellikle yaklaşık 10-20 mL'dir.
- Spor süspansiyonunu el tipi bir püskürtücüye dökün.
- 2 haftalık pirinç fidelerinin pirinç yapraklarına veya 7 günlük arpa fidelerinin arpa yapraklarına yaklaşık 10 mL konidiyal süspansiyon püskürtün ve 25 ° C'de karanlık, nemli bir odada ~ 24 saat inkübe edin. Kontrol bitkilerine %0.025 (h/h) Tween-20 solüsyonu püskürtün.
- Yaprakları 12 saatlik bir fotoperiyot boyunca 25 ° C'de floresan ışığı altında başka bir nemli odaya aktarın.
- Aşılamadan 5 gün sonra hastalık semptomlarını kaydedin. ~6 cm uzunluğundaki hastalıklı pirinç/arpa bıçaklarını inceleyin. Değerlendirme standardı, Uluslararası Pirinç Araştırma Enstitüsü'nün (IRRI) patlama direnci puanlama sistemine göredir. Patlama direnci için puanlama sisteminin detayları Tablo 1'de gösterilmektedir.
- Test edilen suşların enfeksiyonunu değerlendirmek için yaprakların fotoğrafını çekin. Enfeksiyon 3.6cm2'deki lezyon sayısı ile değerlendirildi.
Tablo 1: Patlama direnci için bir puanlama sistemi. Tablo, Uluslararası Pirinç Araştırma Enstitüsü'nden (IRRI) alıntılanmıştır.
| ölçeklemek | Açıklama |
| 1 | Nokta ucu büyüklüğünde küçük kahverengi lekeler |
| 2 | Küçük yuvarlakımsı ila hafif uzun, nekrotik gri lekeler, yaklaşık 1-2 mm çapında, belirgin bir kahverengi kenar boşluğu ile. Lezyonlar çoğunlukla üst yapraklarda bulunur |
| 3 | Lezyon tipi 2'deki ile aynıdır, ancak önemli sayıda lezyon üst yapraklardadır |
| 4 | Yaprak alanının% 4'ünden daha azını enfekte eden, 3 mm veya daha uzun tipik duyarlı patlama lezyonları |
| 5 | Yaprak alanının% 4-10'undan daha azını enfekte eden, 3 mm veya daha uzun tipik duyarlı patlama lezyonları |
| 6 | Yaprak alanının% 11-25'inden daha azını enfekte eden, 3 mm veya daha uzun tipik duyarlı blast lezyonları |
| 7 | Yaprak alanının% 26-50'sinden daha azını enfekte eden, 3 mm veya daha uzun tipik duyarlı blast lezyonları |
| 8 | Tipik duyarlı patlama lezyonları, 3 mm veya daha uzun, yaprak alanının% 51-75'inden daha azını enfekte eder, birçok yaprak ölür |
| 9 | 3 mm veya daha uzun olan tipik duyarlı blast lezyonları, yaprak alanının% 75'inden fazlasını enfekte eder |
