1. M.grisea için mantar kültürü
- Mantar suşları için yulaf ezmeli domates agar (OTA) kültür ortamını hazırlayın.
- 30 - 50 g yulaf ezmesini tartın, bunu 800 mL damıtılmış / deiyonize suya (ddH2O) ekleyin ve karışımı elektrikli tencerede 30 dakika kaynatın.
- Haşlanmış yulaf ezmesi suyunu bir parça gazlı bez ile behere süzün.
- Beherdeki süzüntüye 150 mL domates suyu ve 20 g agar ekleyin ve 1.000 mL'ye kadar ddH2O ekleyin.
2. Deney materyallerinin hazırlanması
- Yaklaşık 50 pirinç tohumu (Oryza sativa) çeşidi Lijiangxintuan-heigu (LTH) ddH2O'da 3 gün bekletin veya yaklaşık 50 arpa tohumu (Hordeum vulgare cv Golden Promise) ddH2O'da yaklaşık 1 gün
bekletin.
- Pirinç veya arpa tohumlarını nemli gazlı beze sarın ve 28 ° C'de 10 cm x 10 cm çapında yaklaşık 30 Petri kabında nemli filtre kağıdına çimlendirin. Pirinç tohumu çimlenme süresi yaklaşık 2-3 gündür ve arpa tohumu çimlenme süresi yaklaşık 2 gündür. Seradaki bağıl nem yaklaşık% 70'tir.
- Pirinç veya arpa fidelerini otoklavlanmış saksı toprağı ve sulama kullanarak saksılara dikin ve ardından üzerlerini bir vermikülit tabakası ile örtün.
- Bitkileri yaklaşık 1 ~ 2 hafta boyunca 25 ° C'de uygun bir seraya veya büyütme kabinine yerleştirin.
- Steril cerrahi makasla (her dairenin çapı 8 cm olmalıdır) 3 kat filtre kağıdını daireler halinde kesin ve 100 mm steril plastik plakalara yerleştirin.
- Filtre kağıdını ıslatmak için her kaba ddH2O ekleyin.
- Filtre kağıdının tamamen ıslak olduğundan emin olun, ancak fazladan su eklemeyin.
- Bir vakum pompası ile fazla suyu alın.
- Pirinç / arpa yapraklarını desteklemek için kültür kabına 2 steril kürdan koyun; kürdanları ~ 2 - 3 cm aralıklarla yerleştirin.
- Tohumları ektikten 2 hafta sonra pirincin yapraklarını toplayın veya tohumları ektikten 7 gün sonra arpanın yapraklarını alın.
- 4 ila 6 yapraklı pirinç/arpa fideleri kullanarak, sapın alt kısmını üstten ~5 cm yükseklikte kesin ve yaprakları toplayın.
3. Miselyum Küpleri veya M. grisea'nın Konidiyal Süspansiyon Damlacıkları ile Yaralama Aşılaması
- Anatomik bir iğne kullanarak, ayrılmış pirinç / arpa yapraklarının ana damarlarında 2-3 cm uzunluğunda üç yara kazıyın; yapraklara nüfuz etmemeye dikkat edin.
- Kazınmış yaprakları kürdan üzerine koyun ve bir damlacık tabakası oluşturmak için yaprakların üzerine %0,02 (h/h) Tween-20 solüsyonu püskürtün.
- Bir OTA plakasından her M. grisea suşu (vahşi tip, mutant, kompleman suşları veya diğer test suşları) için 0,5 cm x 0,5 cm'lik bir misel tıkaç kesin.
- Misel tıkaçlarını veya 25 μL'lik konidiyal süspansiyon damlacıklarını yaralı yaprakların üzerine koyun ve yaprakları 25 ° C'de nemli bir odada 3 - 8 gün inkübe edin.
- Aşılamadan 5 - 7 gün sonra lezyonları inceleyin. Muayene yöntemi, sprey aşılama yöntemi ile aynıdır (bkz. adım 1.3.13).
- ~6 cm uzunluğundaki hastalıklı pirinç/arpa bıçaklarını inceleyin ve test edilen suşların enfeksiyonunu değerlendirmek için fotoğraflarını çekin. Enfeksiyon 3.6cm2'deki lezyon sayısı ile değerlendirildi.
