$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. SPIO-MtbsAb sentezi
- Daha önce bildirilen yöntemleri kullanarak SPIO konjuge 2,2'- (etilendioksi) bisetilamin (EDBE) sentezleyin.
- SPIO-EDBE-süksinik anhidrit (SA) sentezleyin.
- SPIO-EDBE ve SA'nın (1 g; 10 μmol) alkali bir çözeltisini (5 M NaOH; 10 mL)) oda sıcaklığında 24 saat karıştırın.
- Moleküler gözenekli membran tüpü (12.000-14.000 MW kesme) kullanarak 2 L damıtılmış suda 20 değişiklikle çözeltiyi diyaliz edin. Her değişiklik için 6 saat.
- Son olarak, katalizör olarak 1-hidroksibenzotriazol ve (benzotriazol-1-iloksi) triprilidinofosfonyum hekzaflorofosfat kullanarak SPIO-MtbsAb'yi sentezlemek için 400 μL 4.5 mg / mL Mycobacterium tuberculosis yüzey antikoruna (MtbsAb) 100 μL SPIO-EDBE-SA (4 mg / mL Fe) ekleyin ve çözeltiyi oda sıcaklığında 24 saat karıştırın.
- Son olarak, jel filtrasyon kromatografisi yoluyla çözeltileri bağlanmamış antikordan ayırın.
- Reaksiyon karışımını (5 mL) 2,5 cm × 33 cm'lik bir kolona yükleyin ve fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) tamponu kullanarak elüte edin. Bir bikinkoninik asit protein tahlil kiti kullanarak Ab-nanopartikül kompleksini (yani nanoprobu) onaylayın.
2. Parçacık morfolojisi gözlemi ve gevşeme katmanı ölçümü
- 100 kV'luk bir voltajda bir transmisyon elektron mikroskobu kullanarak ortalama parçacık boyutunu, morfolojisini ve boyut dağılımını inceleyin.
- Kompozit dispersiyonu 200 gözenekli bir bakır ızgara üzerine damlatın ve mikroskoba yüklemeden önce oda sıcaklığında havayla kurutun.
- NMR gevşemeölçeri kullanarak 20 MHz ve 37.0 °C ± 0.1 °C'de nanoprobların gevşeme süresi değerlerini (T1 ve T2) ölçün.
- Her ölçümden önce gevşeme ölçeri kalibre edin.
- r 1 ve r 2 gevşemelerini belirlemek için sırasıyla ters çevirme-kurtarma ve Carr-Purcell-Meiboom-Gill darbe dizisi yoluyla oluşturulan sekiz veri noktasından r1 ve r2 değerlerini kaydedin.
3. Hücre görüntüleme
- RPMI 1640'ta insan monositleri THP-1'i %10 fetal sığır serumu, 50 μg/mL gentamisin sülfat, 100 birim/mL penisilin G sodyum, 100 μg streptomisin sülfat ve 0.25 μg/mL fungizon ile 37 °C'de %5 CO2 inkübatörde yetiştirin.
- SPIO-MtbsAb nanoproblarını (2 mM), mikrosantrifüj tüplerinde (1 mL) 1 ×10 7 aktive edilmiş monosit ile önceden inkübe edilmiş 106 koloni oluşturan birim (CFU) Mycobacterium bovis BCG ile 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde 1 saat inkübe edin.
- Tüpleri 200 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Peletleri ortamda (200 μL) yeniden çözün.
- Hızlı gradyan yankı darbe dizisi kullanarak örnekleri tarayın (Tekrarlama süresi (TR) = 500; Yankı süresi (TE) = 20; Çevirme açısı = 10 °) nanoprobun özgüllüğünü ve hassasiyetini belirlemek için 3.0-T MRI ile.
>4. BCG (Bacillus Calmette–Guérin) aşılaması
- Liyofilize aşı veya bakteri stoğunu Sotron'un ortamında yeniden sulandırın ve daha sonra stoğu, daha önce tarif edildiği gibi uygun şekilde dağılana kadar salin ile seyreltin.
- ADIMMÜN'den (Taipei, Tayvan) elde edilen canlı zayıflatılmış bir M. bovis BCG suşunu aşılayın (Connaught suşu; ImmuCyst Aventis, Pasteur Mérieux) 0.1 mL / fare hacminde (ör., 107 CFU) daha önce tarif edildiği gibi farelerin sol veya sağ dorsal skapular derisine intradermal olarak. Negatif kontrol olarak farelere salin enjekte edin. BCG aşılamasından sonra hayvanları günlük olarak izleyin.
- Bakteri aşılamasından 1 ay sonra hayvanları karbondioksit ötenazi kullanarak kurban edin. Dokuyu intradermal aşılama bölgesinden toplayın. Dokuyu% 10 formalin içinde sabitleyin ve 5-10 μm'de seri bölümler için parafine gömün. Asit dirençli bakteriler için hematoksilen/eozin ve Ziehl-Neelsen boyaları ile doku kesitlerini ve ferrik demir için Berlin mavisi ile boyayın.
5. İn vivo MRG
- Hayvan anestezisi için farelere deri altından ketamin (80 mg / kg vücut ağırlığı) ve ksilazin (12 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte edin.
- SPIO-TbsAb problarını (2 nmol / 200 μL) farelerin kuyruk damarlarına enjekte edin. MR görüntü fareleri, prob enjeksiyonundan önce ve hemen sonra ve daha sonra T2 ağırlıklı hızlı spin-eko görüntüleri elde etmek için her 5 dakikada bir 30 dakika boyunca (TR = 3000; TE = 90; görüş alanı = 8).
- Tüm MR görüntülerini, bir Mtb granülom merkezinin ve granülomatöz bir alana bitişik sırt kasının karşılaştırılabilir konumlarında tanımlanmış ilgi bölgelerinin bir ölçümü olan sinyal yoğunluğunu (SI) kullanarak kantitatif olarak analiz edin.
- Kontrast maddelerin enjeksiyonundan önce (SIpre; kontrol) ve enjeksiyondan 0-3 saat sonra (SIpost) SI ölçümünü kullanarak bağıl sinyal artışlarını hesaplayın
[(SIpost - SIpre)/SIpre] × 100
burada SIpre, önceden geliştirilmiş taramadaki lezyonun SI'sıdır ve SIpost, geliştirilmiş taramadaki lezyonun SI'sıdır.