Transfekte Edilmiş Memeli Hücrelerinin Toplu Aşırı Büyüme Kültüründen Antikor Üretimi

Özet

Kaynak: Elgundi, Z. et al., Terapötik Bir Antikorun Laboratuvar Ölçeğinde Üretimi ve Saflaştırılması.J. Vis. Uzm.(2017)

Video, stabil şekilde transfekte edilmiş memeli hücreleri kullanarak terapötik antikorlar üretmek için bir yöntemi göstermektedir. Tripton takviyesi, hücre bölünmesini uyararak aşırı büyümeye neden olur ve daha yüksek bir antikor verimini destekler. Antikor içeren ortam hasat edilir, filtrelenir ve daha sonraki kullanım için saklanır.

Protokol

NOT: Bu protokol için uygun bir memeli ifade vektörü kullanılmalıdır. Burada, iki ifade kaseti içeren tek bir yapı kullanılır (yani, ağır ve hafif zincir ifadesi ayrı destekleyiciler tarafından yönlendirilir). Trastuzumab ağır ve hafif zincirleri daha önce vektöre klonlanmıştı. Bu vektör, Andrew Beavil'in kar amacı gütmeyen bir plazmid deposu aracılığıyla elde ettiği bir hediyeydi.

1. Vektör DNA'nın Kurtarılması ve Ölçek Büyütme

NOT: Vektör DNA, Escherichia coli XL-1 Blue suşunda yumuşak bir agar bıçak kültürü olarak alındı; vektör higromisin direnci taşır.

1. Bıçak kültürünün yumuşak agarına steril bir aşılama bıçağı veya halkası yerleştirin, ardından izole koloniler için 75 μg / ml higromisin ile hazırlanmış bir Luria Bertani (LB) agar plakası çizin. Plakayı 37 °C'de 18-24 saat inkübe edin.
2. Tek bir koloniyi 75 μg/ml higromisin içeren 5 ml Müthiş et suyuna (TB) aşılayın. Kültürü 37 ° C'de 18-24 saat boyunca 225 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.
3. 800 μl kültürü 200 μl %80 gliserol ile bir kriyoviyalde nazikçe karıştırarak ve -80 °C'de dondurarak bir vektör DNA gliserol stoğu hazırlamak için gece boyunca kültürü kullanın.
   1. Şaşkın bir çalkalayıcı şişesinde 75 μg / ml higromisin içeren 100 ml TB'ye 100 μl gece kültürü ekleyin (ör., 1 / 1.000 seyreltme). Kültürü 37 ° C'de 18-24 saat boyunca 225 rpm çalkalama ile inkübe edin.
4. Gece boyunca kültürden sonra, deoksiriboz nükleik asidi (DNA), aşağıdaki istisna dışında, üreticinin midi / maxi hazırlama kiti talimatlarına göre ekstrakte edin ve saflaştırın; son adımda, DNA'yı su ile elüte edin veya yeniden süspanse edin (pH 7.0-8.5).
5. 260 ve 280 nm'de absorbans okumaları ile DNA'nın konsantrasyonunu ve saflığını kontrol edin, ardından DNA'yı -20 °C'de saklayın.
   NOT: İsteğe bağlı (şiddetle tavsiye edilir): Kimliği doğrulamak için vektöre özgü primerler kullanarak DNA dizisi.

2. HEK-293 Hücrelerinin Kararlı Transfeksiyonu

1. HEK-293 hücrelerini (süspansiyon hücreleri) Erlenmeyer şişelerinde %0.1 iyonik olmayan yüzey aktif madde ile desteklenmiş serumsuz ortamda standart protokollere göre büyütün ve koruyun. Her dört günde bir 2 x 10⁵ hücre / ml ve alt kültürde muhafaza edin. 37 °C'de %5 karbondioksit (CO₂) ve 120 rpm dönüş ile kültür hücreleri.
   NOT: Hücreler, transfeksiyondan en az 4 gün ve en fazla 4 hafta boyunca kültürde kalmış olmalıdır. Serum içerikli besiyerlerinde tek tabaka halinde büyütülen HEK-293 hücreleri de bu işlem için kullanılabilir.
2. Transfeksiyondan bir gün önce,% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 2 ml Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) içinde 12 oyuklu bir plakanın kuyucuklarında 3 x 10⁵ hücre / ml'de HEK-293 hücrelerini tohumlayın. Transfeksiyon gününde, hücrelerin% 80-90 birleşme noktasına ulaştığını kontrol edin
3. DNA ve polietilenimi (PEI) transfeksiyon ortamında ayrı ayrı seyreltin ve ardından bunları karıştırın.
   1. Oyuk başına 1.25 μg vektör DNA'yı (12 kuyu için 15 μg) 300 μl transfeksiyon ortamında seyreltin. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
   2. 2.5 μl 1 mg / ml PEI çözeltisini (12 kuyu için 30 μl, yani DNA'nın PEI'ye 1: 2 oranı) 300 μl transfeksiyon ortamında seyreltin. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
   3. Seyreltilmiş PEI'ye seyreltilmiş DNA ekleyin, hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
4. Plakanın her bir oyuğuna damla damla 50 μl DNA / PEI karışımı ekleyin. Transfeksiyon karışımını dağıtmak için plakayı hafifçe sallayın, ardından plakayı 24 saat boyunca 37 °C, %5_CO2'ye yerleştirin.
5. Kuyucuk başına 50 μg / ml higromisin B ekleyin ve plakayı 10 gün boyunca 37 ° C,% 5 CO_2'ye getirin.
   NOT: 10. Günde, transfekte edilmemiş hücreler ölmüş ve plakanın yüzeyinden ayrılmış olacak, oysa stabil şekilde transfekte edilmiş hücreler canlı olacak ve plakaya bağlanacaktır.
6. Kuyucuklardaki ortamı 1/4 hacim serumsuz ortam ve% 10 FBS ile desteklenmiş 3/4 hacim DMEM ile değiştirin (ör. 0.5 ml serumsuz ortam + 1.5 ml DMEM =% 7.5 nihai serum konsantrasyonu) ve 4 gün boyunca inkübe edin.
7. Kuyucuklardaki ortamı 1/2 hacim serumsuz ortam ve% 10 FBS ile desteklenmiş 1/2 hacim DMEM ile değiştirin (ör. 1 ml serumsuz ortam + 1 ml DMEM =% 5 nihai serum konsantrasyonu) ve 4 gün boyunca inkübe edin.
8. Kuyucuklardaki ortamı 3/4 hacim serumsuz ortam ve% 10 FBS ile desteklenmiş 1/4 hacim DMEM ile değiştirin (ör. 1.5 ml serumsuz ortam + 0.5 ml DMEM =% 2.5 nihai serum konsantrasyonu) ve 4 gün inkübe edin.
9. Kuyucuklardaki ortamı% 0.1 iyonik olmayan yüzey aktif madde (yani% 0 nihai serum konsantrasyonu) ile takviye edilmiş 2 ml serumsuz ortam ile değiştirin ve 4 gün inkübe edin.
   NOT: Serumsuz adaptasyon sırasında hücreler üzerinde 50 μg / ml higromisin B seçici basıncını koruyun. Serumsuz ortama adapte edilen hücreler, kuyucukların yüzeyinden ayrılır ve süspansiyon halinde kümelenebilir. 50 μg/ml higromisin B ek takviyesi ile kültür koşulları için adım 2.1'e bakın.
10. Bir pipet kullanarak, 12 oyuklu plaka ve havuz hücrelerindeki süspansiyon kültürlerini ayrı bir tüpe nazikçe karıştırın.
    1. Bir hemositometre kullanarak, havuzlanmış hücreleri ve tohumları 30 ml serumsuz ortamda 2 x 10⁵ hücre / ml'de bir Erlenmeyer şişesinde numaralandırın. 37 ° C'de% 5 CO₂ ve 120 rpm rotasyon ile kültür hücreleri. Alt kültür ve her dört günde bir genişleyin.
11. Sıvı nitrojende kriyoprezervasyon için 1 x 10⁷ hücre/flakonda 10 flakon elde etmek için kültür boyutunu gerekli hücre yoğunluğuna genişletmeye devam edin. Hücreleri% 10 dimetilsülfoksit (DMSO) içeren serumsuz ortamda dondurun.
    NOT: Antikor içeren şartlandırılmış ortam, protein üretimini doğrulamak için her bir alt kültürde hasat edilebilir veya saflaştırma koşullarını optimize etmek için kullanılabilir. Şartlandırılmış ortamı hasat etmek ve alt kültür için hücreleri korumak için, kültürü 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin, ardından süpernatanı 0.22 μm'lik bir filtreden filtreyle sterilize edin. Filtrelenmiş süpernatant, 1-2 hafta boyunca 4 ° C'de veya daha uzun süreli depolama için -20 ° C'de tutulabilir.

3. Toplu Aşırı Büyüme Kültüründen Büyük Ölçekli Antikor Üretimi

NOT: Antikor üretimi, mevcut hücrelerin, kurulacak toplu aşırı büyüme kültürü hacmine bağlı olarak gerekli hücre yoğunluğuna genişletildiği 2.11 adımından itibaren takip edilebilir. Aksi takdirde, kriyoprezervasyondan çözülen hücreler, uygun bir hücre yoğunluğuna ve hacmine genişletildikten sonra bu aşamada başlar. Antikor üretimini optimize etmek için çeşitli kültür takviyeleri kullanılabilir; Antikor verimini artırmak için tripton kullanımı bu protokolde gösterilmiştir.

1. İki Erlenmeyer şişesinde 100 ml serumsuz ortamda 2 x 10⁵ hücre / ml'lik tohum hücreleri (takviye edilmemiş ve besin takviyeli kültürlerden elde edilen antikor verimlerini karşılaştırmak için). 37 °C, %5 CO₂ ve 120 rpm'de kültür.
2. 24 saat sonra, besin takviyesi yapılan kültüre% 0.5'lik bir nihai konsantrasyona tripton ekleyin. Takviye edilmemiş kültürün hacmini serum içermeyen medya ile eşitleyin.
3. 8. günden itibaren, hücre canlılığını izlemek için bir hemositometre kullanarak kültürlerin hücre sayımlarını günlük olarak gerçekleştirin. Hücre canlılığı% 80'den az olduğunda kültür süpernatantlarını hasat edin.
   1. Kültürlerin 15 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjlenmesiyle süpernatanı hasat edin, ardından süpernatanı (antikor içeren) 0.22 μm'lik bir filtreden filtreyle sterilize edin. Süpernatanları 4 °C'de (kısa süreli) saklayın veya -20 °C'de (uzun süreli) dondurun.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
pFUSE vektör serisi	Yok	İnvivoGen	Ağır ve hafif antikor genleri, ko-transfeksiyon gerektiren ayrı vektörlerde ifade edilir.
mAbXpress vektör serileri	Yok	ACYTE Biyoteknoloji Ticaret Ltd. Şti.	Ağır ve hafif antikor genleri, ko-transfeksiyon gerektiren ayrı vektörlerde ifade edilir. Bakınız: Jones, M. L. et al. Rekombinant monoklonal antikorların hızlı, ligasyondan bağımsız yeniden biçimlendirilmesi için bir yöntem. J İmmünol Yöntemleri. 354 (1-2), 85-90, doi:10.1016/j.jim.2010.02.001, (2010).
pVITRO1 vektörü	Yok	Yok	Ağır ve hafif antikor genlerinin her biri, tek bir vektörde ayrı bir promotör tarafından yönlendirilir. Bakınız: Dodev, T. S. et al. Rekombinant antikorların hızlı klonlanması ve ekspresyonu için bir araç kiti. Sci Rep. 4 5885, doi:10.1038/srep05885, (2014).
GS vektör serileri	Yok	Fransa	Ağır ve hafif antikor genlerine sahip çoklu sistronik vektör birlikte eksprese edildi ve tek transkript olarak çevrildi.
Çoklu sistronik vektör serileri 1	Yok	Yok	Ağır ve hafif antikor genlerine sahip çoklu sistronik vektör birlikte eksprese edildi ve tek transkript olarak çevrildi. Bakınız: Li, J. et al. Rekombinant IgG antikorlarının memeli ekspresyonu için farklı vektör tasarımlarının karşılaştırmalı bir çalışması. J İmmünol Yöntemleri. 318 (1-2), 113-124, doi:10.1016/j.jim.2006.10.010, (2007).
Çoklu sistronik vektör serileri 2	Yok	Yok	Ağır ve hafif antikor genlerine sahip çoklu sistronik vektör birlikte eksprese edildi ve tek transkript olarak çevrildi. Bakınız: Ho, SC ve ark. CHO hücre hatlarını eksprese eden yüksek monoklonal antikor oluşumunu arttırmak için IRES aracılı Trisistronik vektörler. J Biyoteknoloji. 157 (1), 130-139, doi:10.1016/j.jbiotec.2011.09.023, (2012).
pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ	61883 Haber Bülteni	Ekle	Higromisin direnç genine sahip trastuzumab antikor genlerini içeren memeli ekspresyon vektörü; pVITRO1-Trastuzumab-IgG1/κ, Andrew Beavil'in bir hediyesiydi.
Hızlı Medya Higro Agar	FAS-HG-S	Jomar Yaşam Araştırması	75 μg/ml higromisin içeren düşük tuzlu LB agar hazırlamak için kullanılır.
Hızlı Medya Higro TB	FAS-HG-L	Jomar Yaşam Araştırması	75 μg/ml higromisin içeren düşük tuzlu TB suyu hazırlamak için kullanılır.
Gliserol, BioXtra, %≥99	G6279	Sigma-Aldrich	Su ve otoklav ile% 80'e kadar hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
Jestar 2.0/LFU Plazmid Maxi Kiti	G221020	Astral Bilimsel	Plazmid Maxi Hazırlık Kiti; DNA'yı suda elüte edin veya yeniden süspanse edin (pH 7.0-8.5).
FreeStyle 293-F Hücreleri	R790-07	Yaşam Teknolojileri	Serum içermeyen ortamda süspansiyon kültürüne uyarlanmış HEK-293 hücre hattı.
FreeStyle 293 İfade Ortamı	12338-018	Yaşam Teknolojileri	293-F hücre hattını ve yüksek protein ekspresyonunu korumak için özel olarak formüle edilmiş serumsuz ortam.
Kollifor P188	K4894	Sigma-Aldrich	İyonik olmayan yüzey aktif madde; pluronik F-68; suda% 10'a kadar hazırlayın ve 0.22 μm filtre kullanarak filtre ile sterilize edin. 4oC'de saklayın.
DMEM, yüksek glikoz	11995-065	Yaşam Teknolojileri
Isı ile İnaktive Edilmiş Fetal Sığır Serumu	10082-147	Yaşam Teknolojileri
Polietilenimin, Doğrusal, MW 25.000	23966	Polibilimler A.Ş.	Suda 1 mg / ml'ye hazırlayın. 1 M HCl ile pH 7.0'a ayarlayın (çözelti berraklaşır) ve 0.22 μm filtre kullanarak filtreyle sterilize edin. Kullanana kadar -80oC'de saklayınız.
OptiPro SFM (Optik Ürün)	12309-050	Yaşam Teknolojileri	Transfeksiyon formüle edilmiş serumsuz besiyeri
Higromisin B Çözeltisi	KARINCINA-HG-1	Jomar Yaşam Araştırması
Dimetilsülfoksit (DMSO)	AJA2225	Thermo Fisher Bilimsel
Tripton (kazein pepton)	LP0042B	Thermo Fisher Bilimsel	PBS'de %20'ye kadar hazırlayın ve 0,22 μm filtre kullanarak filtreyle sterilize edin. 4oC'de saklayın.
BLItz Sistemi	45-5000	fortéBIO (İngilizce	Biyo-katman interferometrisi (BLI) ölçümleri için kullanılan cihaz.

Serisi Gazetesi Serisi Serisi Gazetesi arası )