İmmün kompleksler kullanılarak dendritik hücre aktivasyonunun akış sitometrisi tabanlı analizi

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Tümörle İlişkili Monosit Türetilmiş Dendritik Hücrelerin İzolasyonu

1. Laminer akış başlığında, CO₂ ötenazi uygulanmış farelerden tümörleri çıkarın ve tümörleri fetal sığır serumu (FBS) olmadan RPMI ortamına yerleştirin.
   not: Kürkteki olası kontaminasyonları en aza indirmek için farelerin tıraş edilmesi ve tümörleri çıkarmadan önce üzerlerine %70 etanol püskürtülmesi şiddetle tavsiye edilir. Tümörün 25 - 40^mm2'yi geçmediğinden emin olun, çünkü daha büyük tümörler kırılgan ve hücre ölümüne eğilimli olma eğiliminde olan daha az dendritik hücreye (DC) sahiptir. Daha fazla sayıda DC'ye ihtiyaç duyulursa, her fareye birden fazla bölgede tümör hücreleri enjekte edilebilir.
2. Steril bir laminer başlık altında, ameliyat makası kullanarak tümörleri küçük parçalar halinde (yaklaşık 1 x 1 mm²) doğrayın.
   1. Bir fareden alınan tüm tümör parçalarını, 5 mL Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS), 2 mg / mL kollajenaz IV ve 0.01 mg / mL DNaz I.
      içeren manyetik karıştırma çubuklu 30 mL steril düz tabanlı bir tüpe ekleyin Dikkat: Miyeloid hücreler, kararlı bir durumda bile glikozilasyon yoluyla enerji üretir. Bu nedenle, yalnızca glikoz içeren ortamları kullanın (örneğin, HBSS, Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) ve Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)), çünkü 10 - 15 dakika kadar kısa bir süre için glikoz açlığı hücre ölümü ve 24 saat içinde apoptoza neden olur. Kollajenaz Gram pozitif bakteriler (Clostridium histolyticum) tarafından üretildiği için sadece düşük endotoksin kollajenaz IV kullanın.
3. Yaklaşık 200 - 400 rpm'de 37 ^oC'lik bir inkübatörde manyetik karıştırıcılı 20-30 dakika karıştırın.
4. 5 mL tam ortam ekleyin ve kuvvetlice yeniden askıya alın.
5. Hücreleri 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün. Hücreleri peletlemek için 4 ^oC 400 rcf'de 5 - 10 dakika santrifüjleyin.
   Dikkat: Bazı tümörler nekrotik olduğundan ve nispeten büyük miktarlarda hücre kalıntısı veya hücre dışı matris içerdiğinden, enzimatik sindirimi doğrudan takiben hücreleri izole etmeye çalışmayın. Yalnızca hücreleri elde etmek için hücreleri %15 yoğunluk gradyanlı bir ortama uygulayın.
6. Ozmolaliteyi ayarlamak ve% 100 Percoll stok çözeltisi elde etmek için 1 mL 10x fosfat tamponlu salin (PBS) ile 9 mL yoğunluk gradyan ortamını askıya alın. 1.5 mL yoğunluk gradyan orta stok çözeltisini 8.5 mL HBSS ile karıştırın ve tümör türevi hücre peleti ile kuvvetlice karıştırın. % 15 yoğunluk gradyan ortamının üzerine yavaşça 2 mL DMEM koyun ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 400 rcf'de santrifüjleyin. Hücreler tüpün dibinde bir pelet oluşturacağı için süpernatanları atın.
   1. Peletlenmiş hücreleri% 2 FBS,% 1 penisilin / streptomisin ve 10 mM Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (İzolasyon Tamponu) içeren 10 mL HBSS'de yeniden süspanse ederek iki kez yıkayın ve hücreleri pelet yapmak için 4 ^oC 400 rcf'de 5-10 dakika santrifüjleyin.
   2. Işık mikroskobu altında tripan mavisi kullanarak bir hemositometredeki hücreleri sayın.
7. 1 mL izolasyon tamponunda 1 x 10⁸ hücreyi yeniden süspanse edin ve 30 μL CD11b ⁺ konjuge manyetik boncuklarla 4 ^°C'de 15 dakika inkübe edin.
   DİKKAT: CD11c konjuge boncukların kullanımından kaçının, çünkü bu DC'yi aktive eder ve hücre ölümüne neden olur. Anti-CD16/32 antikorları ile FcγRII ve FcγRIII'ü bloke etmeye çalışmayın. Bloke edici antikorlar FcyWγR'yi bağlar, mitojenle aktive olan protein (MAP) kinazların güçlü fosforilasyonunu indükler ve DC'yi hazırlar.
   1. 9 mL izolasyon tamponu ekleyerek ve 4 ° C'de 5 - 10 dakika boyunca 4^{° C'de}santrifüj hücreleri ekleyerek fazla bağlanmamış boncukları çıkarın.
8. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 1 mL izolasyon tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri önceden yıkanmış bir manyetik sütuna uygulayın. Kolonu 3 mL izolasyon tamponu ile iki kez yıkayın.
   1. Sütunu mıknatıstan çıkarın. Kolonun üzerine 6 mL izolasyon tamponu pipetleyin ve pistonu iterek manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri steril bir toplama tüpüne boşaltın. Hücreleri 400 rcf'de 4 ^{° C'de}5 - 10 dakika
   santrifüjleyin.
   2. Hücreleri 1 x 10⁷ hücre başına 100 μL'de yeniden askıya alın ve aşağıdaki florofor konjuge antikorlarla boyayın: Linaj negatif (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI ve Ly6G), MHCII, Ly-6C.
9. Küçük hücreleri geçitleyerek, yan saçılma (SSC) ve ileri saçılma (FSC) kullanarak hücreleri sıralayın ve 5 ng / mL GM-CSF ile desteklenmiş tam bir ortamda kültürleyin - Makrofajların plakaya yapışmasını sağlamak için hücreleri 37 ^{° C'de}1 saat inkübe edin. Ardından, gevşek ve yapışmayan hücreleri yeni bir kültür kabına aktarın.
   not: Fare MoDC'si CD11b⁺/CD11c⁺/MHCII^hi/Ly6C^lo/int olarak tanımlanır. Ly6C'nin ekspresyonu, tümör modelleri arasında önemli ölçüde değişebilir ve bazı modellerde (örneğin, LMP), MoDC'ler tamamen Ly6C ekspresyonundan yoksundur. Bir 100 mm³ B16F10 tümörü tipik olarak 5 x 10⁴ DC içerir, bu da yaklaşık 4 - 5 x 10⁶ toplam hücre ile sonuçlanır. Bu hücrelerin %10-15'i bağışıklık hücreleri, %8-10'u ise MoDC'dir. DC sayılarının arttırılması, farelere birden fazla bölgede tümör enjekte edilerek elde edilebilir. Diğer miyeloid hücreler CD11c ve Ly6C gibi belirteçleri ifade edebildiğinden, yalnızca küçük SSC / FCS hücrelerini sıralayın.
   opsiyonel: Tümöre sızan monositleri, Ly6C^hi eksprese eden ve MHCII için negatif olan küçük SSC / FSC hücreleri olarak sıralayın. Daha sonra, DC elde etmek için monositleri in vitro olarak 50 ng/mL GM-CSF ile kültürleyin.

2. Tümör-IgG İmmün Komplekslerinin Hazırlanması

1. 75^cm2'lik bir kültür şişesindeki tümör hücrelerini tam DMEM ortamında% 70 birleşime kadar kültürleyin.
   1. Hücreleri kültür şişesinden ayırmak için 2 mL% 0.25 tripsin / EDTA ekleyin ve aşırı tripsinizasyonu önlemek için hücre morfolojisini bir ışık mikroskobu altında izleyin.
   2. Tripsin sindirimini inhibe etmek için 8 mL tam kültür ortamı (2 mL tripsin başına) ekleyin ve hücreleri peletlemek için 5-10 ^dakikaboyunca 4 o C, 400 rcf'de santrifüjleyin.
      not: Ticari bir PCR kiti kullanarak tümör hücrelerini Mycoplasma için kontrol edin. Limulus Amebosit Lizat (LAL) testi kullanılarak Gram negatif bakteriler ve mantar endotoksinleri için test edin). Serum 0.22 μM'den filtrelenmeli ve 9 Federal Düzenlemeler Kodu virüsü için test edilmelidir. Ek olarak, LB agar veya et suyu üzerine 100 - 200 μL damlatarak kültür ortamını ve serumları test edin ve 37 ^{° C'de}2 gün boyunca kültürleyin.
   3. Hücreleri tripsin ve serum kalıntılarından 10 mL PBS'de tekrar süspanse ederek yıkayın ve 5-10 dakika boyunca 400 rcf'de santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve yıkamayı 2 kez daha tekrarlayın.
2. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca% 1.8 tamponlu paraformaldehit içinde sabitleyin.
   1. Hücreleri 10 mL PBS'de tekrar süspanse ederek yıkayın ve 4 ^oC 400 rcf'de 5 - 10 dakika santrifüjleyin.
   2. Süpernatanları aspire edin ve iki kez daha yıkayın.
      opsiyonel: Tümör alım tahlilleri için hücreler, 1 μM karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE) içeren PBS'de 37 ^°C'de 5 dakika inkübe edilerek etiketlenebilir. CFSE daha sonra buzda 10 dakika boyunca tam ortam ile söndürülür. Hücreler, kalıntı boyayı uzaklaştırmak için% 2 serum içeren PBS'de yoğun bir şekilde yıkanmalıdır.
3. Potansiyel spesifik olmayan protein-protein etkileşimlerini bloke etmek için floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tamponunda (% 2 FCS + 5 mM EDTA ile desteklenmiş PBS) ve 0.5 μg / mL anti-CD16 / 32'de hücreleri yeniden askıya alın. 100 μL'de 1 x 10⁵ hücre konsantrasyonunda U şeklinde 96 oyuk / plaka.
   1. 5 μg - 5 ng / 1 x 10⁵ hücre arasında değişen farklı tümör bağlayıcı antikor dilüsyonları ekleyin. Plakayı buz üzerinde 15-20 dk.
      inkübe edin not: IgG antikorları, tarif edildiği gibi protein A kolonları üzerinde saf 20-24 haftalık dişi farelerin serumundan izole edildi.
4. Hücreleri 150 μL PBS ekleyerek ve plakayı 4 ^oC 400 rcf'de 5 - 10 dakika santrifüjleyerek yıkayın.
   1. Süpernatanları atın ve yıkamayı iki kez tekrarlayın. Florofor konjuge ikincil antikor içeren 100 μL FACS tamponunda hücreleri yeniden askıya alın. Plakayı buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.
   2. 200 μL FACS tamponu ekleyerek ve plakayı 5-10 dakika boyunca 400 rcf'de santrifüjleyerek hücreleri yıkayın. Süpernatanları atın ve yıkamayı tekrarlayın.
   3. Akış sitometrisi ile tümör bağlanmasını analiz edin ve hücreleri kaplamak için gereken minimum konsantrasyonu belirleyin.
      not: Lekeli tümör hücrelerinin ortalama floresan yoğunluğunu (MFI) izotip kontrolüne göre en az beş kat artırmayan antikorlar, sonraki fonksiyonel deneylerde kullanılmamalıdır.

3. MoDC'nin Tümör-IgG IC ile Aktivasyonu

1. Tümör hücrelerini, bölüm 2.1 ila 2.4.3'te tarif edildiği gibi minimum IgG konsantrasyonu ile kaplayın
   1. MoDC'yi tümör IC ile etkinleştirmeden bir gün önce, GM-CSF içeren MoDC kültür ortamını değiştirin. Bunu yapmak için, ortamı nazikçe aspire edin ve hücreleri önceden ısıtılmış tam kültür ortamı ile bir kez yıkayın.
      not: İzole edilmiş olgun tümörle ilişkili MoDC, GM-CSF olmadan tam besiyerinde ayrıldıktan sonra ve IC ile aktive edilmeden önce en az 2-3 saat (veya hatta gece boyunca) kültürlenmelidir.
   2. Tümör alım analizleri için, CFSE etiketli tümör IC'yi 1:5 oranında MoDC'ye ekleyin (IC: MoDC) ve 1 x 10⁶ DC başına 1 mL tam ortamda 12-16 saat boyunca gece boyunca inkübe edin.
   3. MoDC aktivasyon deneylerinin FACS analizleri için, 1: 1 (IC: MoDC) oranında tümör-IC ekleyin ve gece boyunca 12 - 16 h.
      not: MoDC'nin 1 μg/mL LPS veya diğer TLR agonistleri ile uyarıldığı pozitif bir kontrol kuyusunun dahil edilmesi şiddetle tavsiye edilir.
   4. Gece boyunca aktivasyonu takiben, süpernatanları aspire edin ve hücreleri izolasyon tamponu veya 10 mM EDTA HBSS ile üç kez nazikçe yıkayın.
   5. DC'yi plakadan ayırmak için, hücreleri 10 mM EDTA içeren 1 mL HBSS'de 2-3 dakika inkübe edin ve hücreleri kuvvetli pipetleme ile ayırın.
   6. Hücreleri 400 rcf'de santrifüjleyin ve %2 FCS, 5 mM EDTA (FACS tamponu) ve 0.5 μg bloke edici antikorlarla desteklenmiş 90 μL PBS'de 1 x 10⁶ DC'yi yeniden süspanse edin. Buz üzerinde 5 - 10 dakika inkübe edin.
   7. Hücrelere 10 μL boyama antikor karışımı ekleyin ve 15 dakika buz üzerinde inkübe edin.
   8. Hücrelere 2 mL FACS tamponu ekleyin ve 4 ^oC 400 rcf'de 5-10 dakika santrifüjleyin.
2. Hücreleri 200 μL FACS tamponunda yeniden askıya alın.
   1. Ölü hücreleri analizlerden çıkarmak için numuneleri çalıştırmadan 1-2 dakika önce 0,5 - 1 μg / mL DAPI ekleyin. DAPI'yi aşırı inkübe etmeyin, çünkü MoDC 10 - 15 dakika içinde alacaktır.