Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Taze dışkı peletlerinin toplanması
- Steril kağıt havlular, künt uçlu forsepsler ve 50 mL konik tüpler hazırlayın.
- Bazı kağıt havluları ve forsepsleri ayrı otoklav torbalarına koyun ve 180 °C'de kuru ateşte 30 dakika otoklavlayın. Steril konik tüpler de kullanın. Konik tüpleri tartın ve ağırlıklarını tüplerin üzerine yazın.
- Hayvan odasındaki biyogüvenlik kabinini açın.
- Herhangi bir yatak takımı olmayan otoklavlanmış temiz bir fare kafesi alın ve biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Kapağı ve yiyecek rafını çıkarın ve kabinin içine yerleştirin.
- Kafesin altına biraz steril kağıt havlu yerleştirin ve metal rafı tekrar kafesin üzerine yerleştirin.
- Yaşa uygun dışkı donörlerini belirleyin ve fare kafesini biyogüvenlik kabinine yerleştirin. Kafesi açın ve bir donör fareyi (C57BL/6J) kuyruğundan nazikçe tutun ve temiz kafesin üzerindeki metal rafa yerleştirin.
- Kafes kapağını rafın üzerine yerleştirin ve hayvan(lar)ın dışkılamasını bekleyin.
NOT: Rafa aynı anda birkaç fare litresi koyun.
- Dışkı peletlerini toplayın ve 50 mL'lik steril bir konik tüpe koyun. Peletleri cinsiyete göre bir araya getirin. Erkeklerden ve dişilerden toplanan dışkı peletlerini karıştırmayın.
- Tüpü tekrar tartın ve dışkı topaklarının ağırlığını hesaplayın.
2. Fekal süspansiyonun hazırlanması
- Steril bir çözelti hazırlayın (normal salinde% 10 gliserol).
- Her gram dışkı peleti için konik tüpe 10 mL %10 gliserol/normal salin ekleyin.
NOT: Gerekirse çözelti hacmini 20 mL'ye yükseltin. Bu çalışmada her pelet için 1 mL çözelti (5-10 mg) kullanılmıştır.
- Dışkıyı yeniden süspanse etmek için karışımı bir tezgah üstü homojenizatör veya çeker ocak içindeki bir blender ile düşük hızda homojenize edin (3 X 30 s).
- Dışkı süspansiyonunu 2 kat steril pamuklu gazlı bezden (10,2 cm x 10,2 cm) süzün. Süzüntüyü geçici olarak buzdolabında 6 saate kadar saklayın veya steril kriyojenik şişelere paketleyin ve -80 °C dondurucuda saklayın.
- Homojenizatörü veya blenderi standart bir prosedür izleyerek iyice temizleyin.
3. Oral gavaj ile dışkı süspansiyonunun uygulanması
- Dondurulmuş numuneler kullanıyorsanız, donmuş dışkı süspansiyonunu buz üzerinde çözdürün. Çözülmüş dışkı süspansiyonunu girdap yaparak karıştırın.
- Taze veya çözülmüş dışkı süspansiyonunu 1 mL şırıngalara aktarın.
NOT: Her fare toplam 200 μL dışkı süspansiyonu alacak ve kontrol grubundaki her IL-10-/- fare 200 μL %10 gliserol/normal salin alacaktır.
- Fareleri tartın ve doğru gavaj iğnesi boyutunu ve maksimum dozaj hacmini seçin.
NOT: Vücut ağırlığı 20-25 gram arasında olan fareler için, 2,25 mm bilyeli 20 G 3,81 cm kavisli bir gavaj iğnesi kullanın. Daha fazla bilgi için lütfen gavageneedle.com kontrol edin.
- Farenin burnunun ucundan ksifoid işlemine (sternumun dibi) kadar olan uzunluğu ölçerek gavaj iğnesini test edin. Şırıngayı %10 gliserol/salin veya dışkı süspansiyonu ile doldurun ve şırınga ve iğnenin içindeki hava kabarcıklarını çıkarın.
NOT: İğne uzunluktan daha uzunsa, iğne miline/borusuna burun hizasında bir işaret koyun. Mide delinmesini önlemek için iğneyi/hortumu hayvanın içinden o noktadan geçirmeyin.
- Biyogüvenlik kabinine bir fare kafesi yerleştirin, plastik kafes kapağını çıkarın ve metal rafı yerinde bırakın.
- Bir fareyi kuyruğundan tutun ve metal rafa koyun. Fareyi bir elinizle kuyruğundan tutun ve diğer elinizin baş ve orta parmaklarını kullanarak cildi omuzların üzerinden kavrayarak hayvanı dizginleyin. Bu şekilde, ön ayaklar yana doğru gerilir, bu da ön ayakların iğneyi dışarı itmesini önleyecektir. Hayvanın başını nazikçe geriye doğru uzatın ve bir elinizle başını yerinde tutun.
NOT: Deneye devam etmeden önce deneyci tam bir güven duyana kadar fare kullanma alıştırması yapın.
- Gavaj iğnesini ağzın içindeki dilin üzerine yerleştirin. İğne yemek borusuna ulaşana kadar üst damak boyunca yavaşça ilerleyin. İğneyi tek hareketle sorunsuz bir şekilde geçirin. Herhangi bir direnç hissedilirse iğneyi zorlamayın. İğneyi çıkarın ve tekrar deneyin.
- İğne düzgün bir şekilde yerleştirildikten ve doğrulandıktan sonra, iğneye bağlı şırıngayı iterek malzemeyi yavaşça uygulayın. İğneyi döndürmeyin veya ileri doğru itmeyin, bu yemek borusunu yırtabilir. Dozlamadan sonra iğneyi yavaşça dışarı çekin.
- Fareyi ev kafesine geri koyun. Nefes almada zorluk veya sıkıntı belirtileri arayarak hayvanı 5-10 dakika izleyin. FMT'den 12-24 saat sonra fareleri tekrar izleyin.
