Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
>1. Glia hücre besleyici yemeklerin hazırlanması (kültür gününden 2 hafta önce)
- Doğum sonrası 1 günlük bir fare beyninden korteksi inceleyin ve meninksleri soyun.
- Temiz bir tezgah üzerinde temiz bir Petri kabında temiz bir makasla korteks dokusunu mümkün olduğunca ince doğrayın.
- Doğranmış dokuyu 12 mL HBSS'ye aktarın ve 1.5 mL% 2.5 tripsin ve% 1 (ağırlıkça / hacim) DNaz ekleyin. 37 °C su banyosunda 15 dakika inkübe edin, her 5 dakikada bir sallayın. İyi sindirilmiş doku yapışkan hale gelir ve büyük bir küme oluşturur. Dokuyu parçalamak ve daha iyi sindirim elde etmek için 10 mL'lik bir pipetle 10-15 kez ezin.
- İyi sindirilmiş dokuyu 5 mL'lik bir pipetle 10-15 kez, çoğu parça kaybolana ve ortam bulanıklaşana kadar ezin. Kalan parçaları çıkarmak için bir hücre süzgecinden geçirin ve 15 mL glia ortamı ekleyin (Minimal esansiyel ortam (MEM), glikoz (ağırlıkça %0.6), %10 (hacim/hacim) at serumu ve Penisilin-Streptomisin (1x) sindirimi durdurmak için.
- Hücreleri 5 dakika boyunca 120 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Hücre peletini taze glia ortamı ve hücre kültürü kaplarında (yaklaşık 105 hücre /cm2) tohum ile yeniden süspanse edin.
- Bağlanmamış hücreleri çıkarmak için ortamı ertesi gün taze glia ortamı ile değiştirin.
- Glia yemeklerini her 3-4 günde bir taze glia ortamı ile besleyin. Ortamı değiştirmeden önce gevşek bir şekilde tutturulmuş hücreleri çıkarmak için şişeyi bir elinizle 5-10 kez tokatlayın.
- 10 günlük kültürden sonra, glial hücreler neredeyse birleşmiş olmalıdır. Glia hücrelerini %0.25 tripsin-EDTA ile ayırın ve 60 mm'lik yeni bir hücre kültürü kabında yaklaşık 105 hücre tohumlayın. Kalan hücreler ileride kullanılmak üzere dondurulabilir.
- Kültür gününden 3 gün önce glia besiyerini nöronal kültür besiyerine değiştirin (1x GlutaMAX-I ve 1x B27 takviyesi ile Neurobazal-A Besiyeri)
2. Kültür hipokampal nöronları
>NOT: Tüm adımlar oda sıcaklığında gerçekleştirilir.
- ANK3-E22 / 23f / f farelerden doğum sonrası 1 günlük yavrulardan 6-8 hipokampusu oda sıcaklığında bir Petri kabında HBSS ortamı ile diseksiyon yapın. Hipokampusu diseksiyon makasıyla daha küçük parçalar halinde doğrayın. Hipokampusu Petri kabından 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Tüpte 5 mL HBSS ile hipokampi 2x'i yıkayın. Yıkadıktan sonra hipokampusu 4.5 mL 1x HBSS'de bırakın.
- 4.5 mL HBSS'ye 0.5 mL% 2.5 tripsin ekleyin ve 37 ° C'lik bir su banyosunda 15 dakika inkübe edin. Tüpü her 5 dakikada bir ters çevirin. İyi sindirilmiş hipokampus yapışkan hale gelmeli ve bir küme oluşturmalıdır. Gerekirse, sindirimi 5 dakika daha uzatın.
- Hipokampusu HBSS ile 3 kez 5 dakika boyunca yıkayın. HBSS'yi çıkarmak için vakum kullanmayın. Hipokampusu çıkarmak çok kolaydır.
- Yıkamadan sonra 2 mL HBSS ekleyin ve hipokampusu bir Pasteur pipeti ile 15 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Dokuyu ateşle parlatılmış bir Pasteur pipeti ile (açıklığın çapı yarı yarıya daralır) 10 kez ezin. Hala parçalar kalsa bile 10 katın ötesine geçmeyin. Aşırı işitme nöronları öldürür.
- Tüm parçalar dibe oturana kadar tüpü 5 dakika dinlendirin. Ayrışmış nöronları içeren süpernatanı kaplama kaplarına (105 hücre / 60 mm tabak) aktarmak için nazikçe 1 mL'lik bir pipet ucu kullanın. Doğrudan önceden kükülenmiş kaplama ortamına ekleyin ve plakayı hafifçe sallayın.
- Parçaların çoğu kaybolana kadar kalan parçalarla 2.6-2.7 adımlarını tekrarlayın.
- Tohumlamadan 2-4 saat sonra, kaplama kaplarını ışık mikroskobu ile kontrol edin. Nöronların çoğunluğu lamel üzerine yapışmış olmalıdır. Ekli hücreler yuvarlak ve parlaktır. İnce uçlu bir forseps kullanarak, balmumu noktaları tarafı aşağı bakacak şekilde önceden koşullandırılmış nöronal kültür ortamı ile glia hücre besleyici tabaklarına lamelleri çevirin.
- Nöronlar, glia hücre besleyici kaplarında 1 aya kadar büyüyebilir. Nöronları her 7 günde bir 1 mL taze nöronal kültür ortamı ile besleyin.
- İsteğe bağlı adım: Tohumlamadan 1 hafta sonra, glial proliferasyonu engellemek için sitozin arabinozit (1-β-D-arabinofuranosilsitozin) 5 μM'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin.
