Donmuş Embriyonik Nöronlardan Düşük Yoğunluklu Primer Nöron Kültürü Oluşturma

Özet

Kaynak: Koganezawa, N. et al., Embriyonik Hipokampal Nöronların Donmuş Stoğunu Kullanarak Kolay ve Tekrarlanabilir Düşük Yoğunluklu Birincil Kültür.J. Vis. Uzm. (2023)

Bu video, kontrollü çözülme, nörobazal bir ortamla seyreltme ve poli-L-lizin kaplı bir plaka üzerine tohumlamayı içeren dondurularak saklanmış embriyonik nöronların kültürlenme yöntemini göstermektedir. Sonraki inkübasyon, nöronal bağlantıların büyümesini ve sürdürülmesini destekler.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Plaka kaplama

1. 96 oyuklu bir mikroplakayı poli-L-lizin (1 mg / mL, 0.1 M borat tamponu [pH: 8.5]; 100 μL / kuyu) ile kaplayın ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin< br / > not: Sadece kullanılması gereken kuyuları kaplayın. Burada yapılan deneylerde ortadaki 60 kuyu kullanılmaktadır. Borat tamponu, sterilize edilmiş suda 50 mM borik asit ve 12 mM borat karıştırılarak hazırlanır.
2. Plakayı iki kez sterilize su (250 μL/kuyu) ile yıkayın.
3. Plakayı takviye olmadan taze kültür ortamıyla bir kez yıkayın (250 μL / kuyu).
4. Plakayı temiz bir tezgahta 20 dakika kurutun.
5. Plakayı alüminyum folyo ile sarın ve kullanana kadar 4 °C'de tutun (1 ay geçerlidir).

2. Hücre tohumlama

1. Kaplanmış plakaya 50 μL/oyuk kültür ortamı ekleyin ve 37 °C,% 5 CO₂ inkübatörde 30 dakika ila 1 saat tutun. Periferik kuyucukları sterilize su (200 μL/kuyu) ile doldurun.
   not: Kültür ortamı, nörobazal ortama 50x B-27, 400x Glutamax ve 100 U/mL penisilin / streptomisin eklenerek hazırlanır (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın).
2. Nöron kriyoviyalini sıvı nitrojen tankından çıkarın. Burada kullanılan nöronlar dimetil sülfoksit kriyoprezervasyonlu (DMSO-kriyoprezervasyonlu) nöronlardı.
3. Cryovial'ı 37 dakikaya kadar 3 °C'lik bir ısı bloğuna daldırın ve içindekileri kısmen çözün. Kriyoviali çok uzun süre ısıtmayın. İçeriği çözülür çözülmez 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
4. Nöron kriyoviyal içeriğini, geniş gözenekli uçlu 1 mL'lik bir pipet kullanarak damla damla (50 μL/s) steril 50 mL'lik bir tüpe yavaşça aktarın.
5. Boş kriyoviali 1 mL kültür ortamı ile durulayın (oda sıcaklığı; RT) tarafından desteklenmektedir. Bu 1 mL kültür ortamını kriyoviyal damladan (50 μL/s) hücre süspansiyonunu içeren 50 mL'lik tüpe aktarın.
6. 50 mL'lik tüpe damla damla (0.5 mL/s) 9 mL kültür ortamı (RT) ekleyin ve hacmi 11 mL'ye yükseltin. Pipetlemeyi tekrarlamayın, hücre süspansiyonunu yavaşça karıştırın.
7. Hücre numarasını sayın (bir hücre sayacı veya hemositometre kullanın).
8. Tüm hücre süspansiyonunu bir rezervuara aktarın ve geniş gözenekli uçlara (1.0 x 10⁴ hücre / oyuk) sahip çok kanallı bir pipet kullanarak hücre süspansiyonunu 96 oyuklu plakaya dağıtın. Kültür ortamının buharlaşmasını azaltmak için, periferik kuyucukları sterilize su ile doldurun (adım 2.1).
   not: Bu çalışma, kültür ortamı buharlaşmasının, ortam değişimi olmayan 3 haftalık bir kültür için küçük olduğunu doğrulamaktadır. Ortamın indirgeme oranı% 3.6'dır (n = 120 kuyu). Bu nedenle, 3 haftalık kuluçka süresi boyunca ozmolalite değişikliği şiddetli olmayacaktır.
9. Nöronları 37 ° C,% 5 CO₂ inkübatörde 1-2 saat inkübe edin.
10. Kültür ortamını oyuk başına 100 μL önceden ısıtılmış kültür ortamı (37 °C) ile değiştirin ve 37 °C,% 5 CO₂ inkübatöre geri koyun (kültür sırasında ortam değişikliği gerekmez).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
96 kuyulu plaka	Zeon Şirketi		yetenekli
96 kuyulu plaka	Greiner	655986
B-27 Uzay Aracı	Gibco (Gibco)	17504-044	MEA plakaları için %2 v/v; normal plakalar için 50x
boraks	Sigma	B-9876	Nihai konsantrasyon 12 mM
Borik asit	WAKO (Uzay Yolu)	021-02195	Nihai konsantrasyon 50 mM
Sığır serum albümini	Kırlangıç	12659-100G	Nihai konsantrasyon: PBS'de% 3
GlutaMAX	Gibco (Gibco)	35050-061	MEA plakaları için 2,5 mM; normal plakalar için 400x
Hücre Analiz Cihazı 2200'de	Sitiva		Floresan görüntüler
Nörobazal	Gibco (Gibco)	21103-049
Penisilin / Streptomisin	Gibco (Gibco)	15140-122	Normal plakalar için 100 U/mL
Penisilin / Streptomisin	Nacalai Tesque	26253-84	MEA plakaları için 100 μg/mL
Poli-L-lizin	Sigma	P2636 Serisi	Borat tamponunda seyreltilmiş (nihai konsantrasyon: 1 mg / mL)
GÖKYÜZÜ Nöronu	AlzMed, Inc.	ARH001	1.0 x 106 hücre/tüp

Serisi Serisi