Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Cam Lamellerin Poli-L-lizin ile Kaplanması
- 200 μg/mL poli-L-lizin (PLL) çözeltisinin 5 mL'lik bir alikotunun buzunu çözerek cam lameller hazırlayın. Bu stok çözeltisini 45 mL saf enjeksiyon dereceli su ekleyerek 20 μg / mL'ye seyreltin. Solüsyonu 50 mL'lik yeni bir konik tüpe filtreyle sterilize edin. Bu tüpü "PLL Steril" olarak etiketleyin.
not: Buz çözme işlemini hızlandırmak için oda sıcaklığında depolanan suyu kullanın.
- Steril PLL solüsyonuna 100 adet steril, yuvarlak, 12 mm cam lamel ekleyin. Düzgün bir kaplama sağlamak için tüpü her 5-10 dakikada bir 2-3 dakika çalkalayın. Lamelleri 1 saat < br /> bu şekilde kaplayın
not: Alman yapımı yuvarlak cam lameller (çap = 12 mm), güvenilir bir kültür yüzeyi sağladıkları ve 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasının kuyucuklarına kolayca sığdıkları için tercih edilir.
- 40 dakika PLL kaplamadan sonra 2 parça kağıt mendil alın ve akış kabinine düz bir şekilde yerleştirin. Kağıdı %70 etanol kullanarak sterilize edin, ardından kırışıklıkları gidermek için düzleştirin ve kurumaya bırakın.
- Cam lamelleri 1 saat boyunca PLL ile kapladıktan sonra, fazla PLL çözeltisini çıkarın ve steril enjeksiyon dereceli su ekleyin. Fazla PLL'nin çıkarılmasına izin vermek için lamelleri 2-3 saniye boyunca hafifçe çalkalayın. Bu durulama adımını 2 kez daha tekrarlayın.
- Fazla suyu alın ve ardından lamelleri steril kağıt mendile aktarın. Her bir lamel kavisli forseps kullanarak dikkatlice ayırın ve kurumaya bırakın.
not: Kolay kolay ayrılmayan lameller atılabilir. Alternatif olarak, ayırmaya yardımcı olmak için az miktarda su eklenebilir.
- Kuruduktan sonra, lamelleri 24 oyuklu bir kültür plakasına aktarın.
not: Diseksiyon işlemine başlamadan yaklaşık 30 dk-1 saat önce lameller hazır hale getirilmelidir. Plakalar bir inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2 'de istenene kadar saklanabilir.
2. Hipokampal ve Kortikal Dokunun Ayrışması
- Hücre kültürü çözeltilerinin hazırlanması
- Nöral dokunun ayrışması için, önce 40 mL'lik bir hücre kültürü tamponunun buzunu çözün (bileşim [mM cinsinden]: 116 NaCl, 5.4 KCl, 26 NaHCO3, 1.3 NaH2PO4, 1 MgSO4 · 7H2O, 1 CaCl2 · 2H2O, 0.5 EDTA · 2 Na · 2H2O ve 25 D-glikoz, pH = 7.4). 15 mL'lik konik bir tüpe 12 mL hücre kültürü tamponunu ölçün; etiketini "BSA" olarak yapıştırın. 5 mL hücre kültürü tamponunu farklı bir 15 mL tüpe ölçün; "Papain" olarak etiketleyin. Her iki tüpü de 37 ° C'de 15 dakika boyunca bir su banyosunda inkübe edin.
- Kalan hücre kültürü tamponunu filtreyle sterilize edin, "Tampon - Steril" olarak etiketleyin ve gerekene kadar 4 ° C'de saklayın.
- 120 mg Sığır Serum Albümini (BSA) tartın ve "BSA" etiketli tüpe ekleyin. 7 mg papain tartın ve "papain" etiketli tüpe ekleyin. Her iki tüpü de 15 dakika su banyosuna geri koyun< >
not: Papain tozunun transferini kolaylaştırmak için tartı teknesine az miktarda tampon eklemek faydalı olacaktır.
- Tüm tozlar çözüldükten sonra, her bir çözeltiyi 15 mL'lik taze bir konik tüpe filtreyle sterilize edin. Tüp papain için, filtrelenmiş çözeltiyi "papain - Steril" olarak etiketleyin. Tüp BSA için, steril BSA solüsyonunu her biri 4 mL BSA solüsyonu içeren 3 tüpe bölün. Her tüpü "BSA - Steril" ve "1", "2" veya "3" olarak etiketleyin. Tüm tüpleri su banyosuna geri koyun ve gerekli olana kadar 37 °C'de inkübe etmeye devam edin.
- Doku diseksiyonu için hazırlık
- Tek bir parça 35 mm filtre kağıdı alın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve% 70 etanol ile sterilize edin; 100 mm'lik bir Petri kabının kapağında, bir akış kabininde kurumaya bırakın. Hipokampus ve korteksin diseksiyonu için gerekli olan makas, forseps, neşter ve spatulayı (Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin.
- İki adet 35 mm'lik Petri kabı ve steril filtre kağıdı içeren 100 mm'lik bir Petri kabını, akış kabininin ortasında erişilebilir bir yere yerleştirin.
- Transgenik NexCre toplayın; Ai9 ve VGAT Venüs fare yavruları disseke edilecek. Floresan yavruları vahşi tip yavrulardan ayırt etmek için uygun uyarma ve emisyon filtrelerine sahip bir floresan lamba kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).
- Hayvanları diseksiyona tabi tutmadan hemen önce, her 35 mm'lik Petri kabını soğutulmuş, steril hücre kültürü tamponu ile doldurun.
not: Bir Petri kabı diseksiyonlar arasındaki aletleri temizlemek için, diğeri ise hipokampus ve korteksi toplamak içindir.
- Doku diseksiyonu
- Hücre kültürü tamponu dökülür dökülmez, büyük, keskin bir makas kullanarak doğum sonrası 0-2 gün transgenik fare veya sıçan yavrusunun kafasını kesin ve kafayı akış kabinine aktarmak için steril bir 100 mm Petri kabı kullanın. Transgenik bir yavrunun beynini steril filtre kağıdına dikkatlice aktarmak için forseps, makas ve spatula kullanın.
- Beyinciğini incelemek ve 22 yarım küreyi ayırmak için tip 2 neşter kullanın. Yarım küreleri yanlamasına yuvarlamak için küçük bir spatula kullanın. Her yarım kürede, korteksin filtre kağıdı ile temas etmesi için hafifçe bastırın. Hipokampus ve korteksi ortaya çıkarmak için orta beyin bölgelerini nazikçe hareket ettirin.
not: Yarım kürelere bastırırken çok fazla baskı uygulamamaya dikkat edin, aksi takdirde hücreler ezilebilir.
- Hipokampus ve korteksi her yarım küreden ayırmak için bir neşter veya spatula kullanın. Diseke edilmiş dokuyu soğutulmuş hücre kültürü tamponu içeren 35 mm'lik bir Petri kabına aktarın.
not: Birden fazla hayvanı inceliyorsanız, steril hücre kültürü tamponunu buz üzerinde 50 mL'lik konik bir tüpte saklayın. Her diseksiyondan sonra, diseke edilmiş dokuyu soğutulmuş hücre kültürü tamponuna aktarın.
- Kortiko-hipokampal dokunun başarılı bir şekilde diseksiyonundan sonra, steril papain solüsyonunu su banyosundan akış kabinine aktarın. Diseke hipokampus ve korteksi 35 mm'lik steril bir Petri kabının kapağına aktarmak için 3 mL'lik bir Pasteur pipeti kullanın. Tip 22 neşterin düz kısmını kullanarak, doku küçük parçalar halinde olana kadar çapraz hareketlerle doğrayın.
- Doğranmış dokuyu Petri kabının kapağından steril papain tüpüne aktarmak için az miktarda papain solüsyonu kullanın. Papain tüpünü su banyosuna geri koyun ve dokuyu 37 °C'de 25 dakika inkübe edin.
- Papain inkübasyonu sırasında, tam floresan ortam çözeltisi oluşturun. 1 mL'lik bir B27 alikotunu, 0.5 mL'lik bir Glutamax alikotunu ve 0.5 mL'lik bir Pen-Strep alikotunu çözün. Aliquot 48.5 mL Hibernate 50 mL konik tüpe düşük floresan ortam. Solüsyona B27, Glutamax ve Pen-Strep ekleyin. Solüsyonu iyice çalkalayın, ardından filtreyle sterilize edin ve "Hibernate A complete media" (tarih ve baş harfleri ile) olarak etiketleyin. 37 °C'de bir su banyosunda inkübe edin.
- Papain inkübasyonundan sonra, papain tüpünü ve steril BSA tüplerini akış kabinine aktarın. Papain tüpünden sadece kortiko-hipokampal dokuyu BSA tüpüne çıkarmak için 1 mL Pasteur pipeti kullanın 1.
not: Fazla papain çözeltisinin transferini en aza indirmeye dikkat edin.
- Hücrelerin ayrışması
- Büyük doku kümelerini parçalamak için, 1 mL'lik bir Pasteur pipeti kullanarak dokuyu birkaç kez ezin. Bunu takiben, ince uçlu bir Pasteur pipeti kullanarak dokuyu 7 kez ezin. Dokuyu 30 saniye bekletin ve daha büyük doku parçalarının çökelmesine izin verin.
- 30 saniye sonra, alttaki 1 mL çözeltiyi ve dokuyu BSA tüpü 1'den BSA tüpü 2'ye aktarın. İnce uçlu bir Pasteur pipeti kullanarak BSA tüpü 2'deki dokuyu birkaç kez tritüre edin.
- Tritürasyondan sonra, alt 1 mL dokuyu ve çözeltiyi BSA tüpü 1'den, ancak şimdi BSA tüpü 3'e tekrar aktarın. İnce uçlu bir Pasteur pipeti kullanarak BSA tüpü 3'teki dokuyu birkaç kez tritüre edin.
- Tritürasyondan sonra, tüm çözelti ve dokuyu tüp 2 ve 3'ten BSA tüpü 1'e aktarın. 2-3 kez daha öğütün ve 3.000 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.
- Santrifüjleme sırasında, tam Nöral Bazal A ortamı (NBA ortamı) oluşturun. 48,5 mL NBA ortamını 50 mL'lik konik bir tüpe alın ve 37 °C'de bir su banyosunda inkübe edin. Bu tüpü "yalnızca NBA" olarak etiketleyin. Ek olarak, oda sıcaklığında 1 mL'lik bir B27 alikotunu, 0.5 mL'lik bir Glutamax alikotunu ve 0.5 mL'lik bir Pen-Strep alikotunu çözün.
- Santrifüjlemeyi takiben, süpernatanı peletlenmiş dokudan dikkatlice çıkarın ve hücreleri 2 mL tam ortamda yeniden süspanse edin. Dokuyu 20 kez yukarı ve aşağı öğütmek için bir P1000 pipeti kullanın.
not: Hücreleri çok kuvvetli bir şekilde pipetlememeye dikkat edin. Çok fazla basınç uygulanırsa hücreler zarar görebilir.
- Hücre süspansiyonunu 30 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek bir polistiren numune tüpüne süzmek için 1 mL'lik bir Pasteur pipeti kullanın.
not: Hücre süspansiyonu hücre süzgecinden hemen geçmezse, akışı başlatmak için eleğin üstüne steril bir eldivenle bastırmak gerekebilir. Bu önemli adım, hücre sıralayıcının tıkanmasını önler.
- Sıralamadan sonra nöronları toplamak için, 300 μL tam ortamı gerekli sayıda polipropilen tüpe pipetleyerek toplama tüplerini hazırlayın.
- Hücre süspansiyonu artık tasnif için hücre sıralayıcıya götürülmeye hazırdır. Numunenin seyreltilmesinin gerekli olması durumunda hücre süspansiyonunu, ekstra toplama tüplerini ve yedek tam ortamı alın.
3. Saflaştırılmış GABAerjik veya Glutamaterjik Nöronların Hücre Sıralaması
NOT: Ayıklama sırasında bakteriyel kontaminasyon olasılığını en aza indirmek için, ayırmadan önce ayıklayıcının numune tüpünü en az 5 dakika boyunca %70 etanol ile durulayın. Ayrıntılı sıralama parametreleri enstrümanlar arasında farklılık gösterir, temel hususlar aşağıdaki gibidir.
- İlk hücre sıralaması sırasında, vahşi tip bir hayvandan alınan hücreleri sıralayarak ve karşılaştırarak etiketlenmemiş hücrelerden arka plan floresan seviyeleri belirleyin.
- Sıralanacak her floresan hücre tipi için uygun uyarma ve emisyon filtrelerini seçin. Sırasıyla 488 nm veya 531 nm uyarma dalga boylarını kullanarak Venüs ve TdTomato proteinlerini uyarın. Sırasıyla 530/40 ve 575/30 emisyon filtre setleri aracılığıyla yayılan ışığı algılayın.
- Hücre toplama için hücre sıralayıcıya 300 μL tam ortam içeren polipropilen toplama tüpleri ekleyin.
- Yüksek saflık için, parlak etiketli floresan hücreleri sıralayın (örneğin, sıralanmış hücrelerin nokta grafikleri için Şekil 1B'ye bakın).
- Sıralamanın ardından, en iyi sonuçlar için, saflık seviyelerini tahmin etmek için sıralanan hücrelerin saflık testini yapın. Sıralamayı takiben hücrelerin tipik geri kazanım oranının %70-80 arasında olduğunu unutmayın.
- Her toplama tüpünde sıralanan hücre sayısını not edin. Bu değer hücre sıralama aracı tarafından verilir.
not: Hücre sınıflandırması, 70 μm'lik bir nozul (70 psi kılıf sıvı basıncı) veya 100 μm'lik bir nozul (20 psi kılıf sıvı basıncı) kullanılarak gerçekleştirilebilir.
4. Sıralanmış Nöronların Kültürlenmesi
- Hücre tasnifini takiben, toplanan hücreleri 1 mL'lik bir Pasteur pipeti kullanarak 2 mL'lik yuvarlak tabanlı santrifüj tüplerine aktarın. Bir hücre peleti oluşturmak için hücreleri 3.000 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.
not: Hücre peletinin yerini belirlemeye yardımcı olmak için, yuvarlak tabanlı santrifüj tüplerini, kapağın menteşesi dışa bakacak şekilde yönlendirin, bu da hücre peletinin santrifüj tüpünün arkasında (yani, tüpün menteşe ile aynı tarafında) oluşmasına izin verir.
- Santrifüjleme sırasında, 48,5 mL önceden ısıtılmış NBA ortamına 1 mL B27, 0,5 mL Glutamax ve 0,5 mL Pen-Strep ekleyin. Solüsyonu iyice çalkalayın, ardından filtreleyin, sterilize edin ve "NBA complete media" (tarih ve baş harfleri ile) olarak etiketleyin. Gerekene kadar su banyosuna geri dönün.
- Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı farklı bir santrifüj tüpüne aktarmak için 1 mL'lik bir Pasteur pipeti kullanın (hücre peletinin bozulması durumunda süpernatanı koruyun). 1.000 hücre/μL'lik bir hücre yoğunluğu elde etmek için hücre peletini gerekli miktarda önceden ısıtılmış tam NBA ortamında yeniden süspanse edin. Bir P200 veya P1000 pipeti ile yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri yeniden süspanse edin.
- Ayrışmış hücrelerin varlığını doğrulamak için, hücre çözeltisini 4x veya 10x objektif lens kullanarak mikroskop altında kontrol edin. Alternatif olarak, az miktarda hücre solüsyonunu bir lamel üzerine pipetleyin ve mikroskop altında kontrol edin. Çok sayıda hücre varsa, adım 4.3'teki süpernatan atılabilir.
- Hücreleri kaplamadan önce, eşit bir hücre süspansiyonu sağlamak için 2-3 saniye orta hızda girdap yapın. Girdaplamayı takiben, 10 μL hücre süspansiyonunu her bir lamel ortasına hızlı bir şekilde pipetleyin. Hücreleri pipetledikten sonra, her bir plakayı hızlı bir şekilde inkübatöre (%5 CO2/37 °C) geri koyun ve 1 saat
inkübe edin
not: Birden fazla 24 oyuklu plakaya hücre ekliyorsanız, hücreleri plakalar arasında vorteksleyerek hücre yoğunluklarının eşit olduğundan emin olun.
- 1 saat sonra, hücreleri 500 μL önceden ısıtılmış tam NBA ortamı ile besleyin ve inkübatöre geri dönün.
not: Hücreleri beslerken, hücre ayrılmasını önlemek için ortamı kuyunun kenarından nazikçe pipetlemek önemlidir. Kısa deneyler için (<16 gün), yukarıdaki yoğunlukta besleme gerekli değildir. Daha büyük bir hücre yoğunluğu kaplarken, daha sık besleme aralıkları gerekebilir.
