1. Medya Hazırlama
>NOT: Protokol, iki ayrı ortamın bir karışımını kullanmaya dayanır: modifiye N2 takviyesi ile desteklenmiş DMEM/F12 ve tipik olarak 1:1 oranında B27 takviyesi ile desteklenmiş Nörobazal.
- Bileşenleri 15 ml'lik bir tüpte karıştırarak modifiye edilmiş N2 takviyesini hazırlayın. Bunu girdaplamayın veya filtrelemeyin; Çözelti berraklaşana kadar tüpü ters çevirerek karıştırın.
- 7.2 ml DMEM / F12 pipetleyerek başlayın, ardından 1 ml 25 mg / ml insülin (0.01 M HCl'de oluşur) ekleyin ve tüpü ters çevirerek iyice karıştırın. Çözelti berraklaşana kadar birkaç dakika sürer.
- 1 ml 100 mg / ml apo-transferrin (suda yapılır), 33 μl 0.6 mg / ml progesternon (etanolde yapılır), 100 μl 160 mg / ml (1 M) putresin (suda yapılır), 10 μl 3 mM sodyum selenit (suda yapılır) ve 666 μl% 7.5 sığır serum albümini ekleyin ve tüpü iyice karıştırın. 2,5 ml içine alın ve -20 ° C'de 2 aya kadar saklayın.
- Medyayı hazırlayın.
- 250 ml DMEM / F12'ye 2.5 ml N2 ekleyin. İyice karıştırın, ancak sallamayın veya süzmeyin.
- 250 ml Nörobazal besiyerine 5 ml B27 takviyesi ekleyin. İyice karıştırın, ancak sallamayın veya süzmeyin.
- 1.2.1 ve 1.2.2 adımlarındaki ortamı 1:1 oranında karıştırın. Bazı durumlarda 1:3'lük bir karışım gerekebilir (adım 1.2.4'te 1:1'lik karışım olarak eklenmiştir).
- Karışıma 0.5 ml L-glutamin (son konsantrasyon 0.2 mM) ve 3.5 μl 2-merkaptoetanol (son konsantrasyon 0.1 mM) ekleyin ve çalkalamadan iyice karıştırın. Ortamı 4 °C'de 3 haftaya kadar saklayın ve ışığa maruz bırakmaktan kaçının. Bu son karışıma N2B27 denir.
- Jelatin çözeltisini hazırlayın.
- Ultra saf suda %1'lik bir jelatin çözeltisi hazırlayın ve 121 °C, 15 psi'de 15 dakika boyunca otoklav yapın. Bunun için kullanılan şişenin deterjanlardan veya dezenfektanlardan tamamen temiz olması önemlidir, bu nedenle bunun için yeni bir şişe kullanılması ve kullanımlar arasında yalnızca ultra saf suda durulanması önerilir. % 1'lik çözeltiyi 50 ml'lik alikotlara alın ve aylarca 4 ° C'de tutun.
- %1'lik bir jelatin alikotunu 37 ° C'lik bir su banyosunda eriyene kadar ısıtın ve 500 ml ılık fosfat tamponlu tuzlu suya (PBS) ekleyin. İyice karıştırın ve her bir kuyucuğun veya plakanın dibini kaplayacak kadar pipetleyin. Jelatinin yüzeyi en az 30 dakika kaplamasına izin verin.
2. Hücrelerin Kaplanması
NOT: Bu protokol, lösemi inhibitör faktörü (LIF) ile %10 serumda yetiştirilen fare ESC'ye, LIF ile serum replasmanına veya LIF ile serum içermeyen besiyerine ve kemik morfogenetik proteini 4 (BMP4) veya LIF ile veya LIF olmadan MEK ve GSK3 inhibitörlerine (2i besiyeri) eşit olarak uygulanır. Bununla birlikte, farklılaşmanın zamanlaması ve verimliliği, ortama ve hücrelere bağlı olarak değişebilir. Burada gösterilen deneyler için,% 10 serum ve LIF ile GMEM'de büyütülen 46C fare ESC hattını (endojen Sox1 alellerinden birine çarpmış bir EGFP raportörü ile) kullandık. En iyi sonuçlar için, hücrelerin N2B27 ortamında ayrılması ve yeniden kaplanması önemlidir; Ortamın GMEM/serum/LIF'den N2B27'ye basitçe değiştirilmesi, hücrelerin yeniden kaplanmasına kıyasla her zaman daha düşük bir farklılaşma verimliliğine neden olur.
- Hücreleri GMEM'de %10 serum, 1 mM sodyum piruvat, 1x esansiyel olmayan amino asit, 0.1 M 2-merkaptoetanol ve 100 birim / ml LIF13 ile büyütün. Fare ESC'nin subkonfluent kültürünü elde etmek için, 1 x 106 hücreyi 2-3 gün sürecek bir T25 kültür şişesine yerleştirin.
- Hücreleri parlak alan mikroskobu altında gözlemleyin. Hücreler subbirleştiğinde ve geçişe hazır olduğunda, PBS'de iki kez durulayın. 1 ml hücre ayrışma reaktifi ekleyin ve 2-5 dakika inkübatöre geri dönün. Tripsin ve diğer enzimler hücre ayrışması için de kullanılabilse de, hücre bağlanmasını olumsuz yönde etkileyebilirler, bu nedenle kaplama yoğunluklarının ayarlanması gerekecektir.
- Hücreler plakadan kalkmaya başladığında, onları tek bir hücre süspansiyonuna çıkarmak için damara hafifçe vurun. Hücreleri 10 ml ortam ve hücre ayrışma reaktifine toplayın ve 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne pipetleyin.
- Hücreleri RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
- Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve peleti 10 ml önceden ısıtılmış N2B27 içinde 3-5 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Süspansiyonu aşağı pipetlerken, kabarcık oluşmasını önlemek için tüpün yan tarafına pipetleyin. Hücreleri otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre ile sayın ve konsantrasyonu kaydedin.
- Önceden ısıtılmış N2B27'de oyuk başına kaplanacak hacim birimi başına istenen sayıda hücre içeren bir hücre süspansiyonu hazırlayın. 6 oyuklu bir tabaktacm2 başına 10.500 hücre yoğunluğu (yani, 6 oyuklu bir tabağın oyuğu başına 1 x 105 hücre) optimaldir. cm2 başına önerilen hücre sayısı ve çeşitli hücre kültürü kapları için kaplama ortamı hacimleri için Tablo 1'e bakın.
- Jelatini kültür kabından aspire edin ve hücre süspansiyonunu Tablo 1'de önerilen yoğunluk ve hacme göre plakalayın. Plakaları döndürmeyin, çünkü bu hücreleri merkeze yoğunlaştıracaktır. Kültürleri 37 °C,% 5 CO2'de nemli bir inkübatöre yerleştirin.
- Tüm medyayı yeni N2B27 ile değiştirerek medyayı her 1-2 günde bir değiştirin. Hücreleri yıkamak yoğunluğu etkileyebileceğinden ve sonraki günlerde farklılaşma verimliliğini azaltabileceğinden nazikçe pipetleyin. Kaplamadan sonra ilk canlılığın zayıf olduğu durumlarda, hücreleri N2 ve B27 takviyeli ortamın 1: 3 oranında bir karışımında kaplayın ve ilk iki gün sonra bunu N2B27 olarak değiştirin. Hücreler farklılaşmaya başlayacak ve 4 - 6 gün içinde Sox1 ekspresyonunu (burada kullanılan 46C hücre hattındaki raportörün yeşil floresansı ile görülebilir) göstermelidir.
Tablo 1. Farklı kap boyutları için önerilen kaplama yoğunlukları ve ortam hacimleri. Bu tablodaki kaplama yoğunlukları 46C hücre hattı kullanılarak belirlenmiştir. En iyi sonuçlar için, her bir hattın kaplama yoğunluğunun ayarlanması gerekebilir.
arası
arası
| peron | Etkin yoğunluk aralığı (hücre/cm2) | Plaka için hücre sayısı aralığı | Önerilen ilk ortam hacmi (μl) | 1. günden sonra önerilen medya hacmi (μl) |
| 6 oyuklu plaka | 10.500 - 36.500 | 99.750 - 346.750 | 1.000 | 2.000 |
| 24 oyuklu plaka | 15.600 - 46.800 | 29.640 - 88.920 | 500 | 1.000 |
| 96 oyuklu plaka | 103.500 - 260.000 | 33.120 - 83.200 | 100 | 200 |