Method Article

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Postganglionik Sempatik Nöronların Üretilmesi

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Wu, H. F., et al. Besleyicisiz ve Kimyasal Olarak Tanımlanmış Kültür Koşulları Altında İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Kullanılarak Postganglionik Sempatik Nöronların Verimli Farklılaşması. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu video, insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) postganglionik sempatik nöronlar oluşturmak için in vitro bir yöntemi göstermektedir. hPSC'ler, bir farklılaşma ortamı kullanılarak bir bazal membran matris desteği üzerinde nöral krest hücrelerine (NCC'ler) farklılaştırılır. NCC'ler daha sonra ayrışır ve başka bir farklılaşma ortamı kullanılarak sferoidler haline getirilir. Son olarak, sferoidler, sempatik bir nöron ortamı kullanılarak postganglionik sempatik nöronlara dönüştürülür.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bulaşık kaplama, ortam hazırlama ve hPSC bakımı için kurulum

  1. Bulaşık kaplama
    1. Vitronektin (VTN) kaplama
      1. VTN şişelerini tamamen çözülene kadar 37 ° C'lik bir su banyosuna koyun, ardından iyice karıştırın.
      2. 100 mm'lik bir Petri kabı için, 7 mL 1x fosfat tamponlu salini (PBS) 0,5 mg / mL VTN ile karıştırın, tabağa VTN çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin.
    2. Bodrum membran matris kaplama
      1. Bazal membran matrisi şişelerini (Malzeme Tablosuna bakınız) gece boyunca 4 °C'de buz üzerinde çözdürün.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Şekil 1: NC indüksiyonu. (A) 0. günden 10. güne kadar NC indüksiyonu için zaman çizelgesi ve tedaviler. (B) NC sırtlarının morfolojisi ve oluşumu her 2 günde bir parlak alan mikroskobu ile izlendi. 2. günden sonraki her zaman noktasındaki hücreler AP2A (kırmızı) ve SOX10 (yeşil) için birlikte boyandı. Tüm immünofloresan resimler DAPI ile boyandı. Kırmızı oklar sırtlar.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm hücre kültürü kaplarıdoğan353003
15 mL konik doku kültürü tüpleriVWR/Corning89039-664
24 oyuklu doku kültürü plakalarıdoğan353047
24 kuyulu ultra düşük bağlantı plakalarıCorning07 200 601 ve 07 200 602
% 5 CO2/20% O2 doku kültürü inkübatörüThermo Fisher/Yaşam TeknolojileriHeracell VIOS 160i
50 ml konik doku kültürü tüpleriVWR/Corning89039-656
6 oyuklu doku kültürü plakalarıYardımcı yıldız3516
Aktatazİnovasyon Hücre TeknolojileriAT104500Hücre ayrışma çözümü
Anti-AP2a antikoruAbcam Belediyesiab108311Ev sahibi: Tavşan; 1:400 seyreltme
Anti-Ascl1 antikoruBD Pharmingen556604Ana bilgisayar: Fare IgG1; 1:200 seyreltme
Anti-CD49D antikoruBiyo Efsane304313Ana bilgisayar: Fare IgG1; 100 μl hacimde 5 μl/milyon hücre
Anti-CD49D antikoru (izotip)Biyo Efsane400125Ana bilgisayar: Fare IgG1; 100 μl hacimde 5 μl/milyon hücre
Anti-DAPI antikoruSigmaD95421:1000 seyreltme
Anti-DBH antikoruİmmünostar22806Ev sahibi: Tavşan; 1:500 seyreltme
Anti-GFP antikoruAbcam BelediyesiAB13970Ev sahibi: Tavuk; 1:1000 seyreltme
Anti-HOXC9 antikoruSanta Cruz BiyoteknolojiSC-365692Ana bilgisayar: Fare IgG1; 1:100 seyreltme
Anti-NET1 antikoruMemiliNET17-1Ana bilgisayar: Fare; 1:1000 seyreltme
Anti-PRPH antikoruSanta Cruz BiyoteknolojiSC-377093/H0112Ana bilgisayar: Fare IgG2a; 1:200 seyreltme
Anti-SOX10 antikoruAbcam Belediyesiab50839Ana bilgisayar: Fare; 1:100 seyreltme
Anti-TH antikoruPel-DondurmaP40101- 150Ev sahibi: Tavşan; 1:500 seyreltme
Askorbik asitSigmaA8960-5GStok konsantrasyonu: 100 mM
B27 takviyesiThermo Fisher/Yaşam Teknolojileri12587-010Stok konsantrasyonu: 50x
BDNF (BDNF)Ar-Ge Sistemleri248-BDStok konsantrasyonu: 10 μg/mL
BMP4Ar-Ge Sistemleri314-BPStok konsantrasyonu: 6 mM
Hücre sayacıThermo Fisher/Yaşam TeknolojileriKontes II
Hücre sayma odası slaytlarıCanlandırıcıC10312
merkezkaçEppendorf Belediyesi57021 ve 5424R
CHIR99021Ar-Ge Sistemleri4423Stok konsantrasyonu: 6 mM
Kriyo-flakonThermo Fisher/Yaşam Teknolojileri375353
dbcAMPSigmaD0627Stok konsantrasyonu: 100 mM
DMEM (Ömer ÇiçeğThermo Fisher/Yaşam Teknolojileri10829-018Stok konsantrasyonu: 1x
DMEM/F12Thermo Fisher/Yaşam Teknolojileri11330-057Stok konsantrasyonu: 1x
DMSO (Türkçe)Thermo Fisher/Yaşam TeknolojileriBP231-100
E6 ortaGibco ŞirketiA15165-01
E8 ortaGibco ŞirketiA15169-01Stok konsantrasyonu: 1x
E8 takviyesiGibco ŞirketiA15171-01Stok konsantrasyonu: 50x
EdtaSigmaED2SSStok konsantrasyonu: 0,5 M
FACS makinesiBeckman Coulter'ın fotoğrafı.CytoFLEX (FACS için)
FACS makinesiBeckman Coulter'ın fotoğrafı.MoFlo Astrios EQ (sıralama için)
FACS tüpleri (mavi filtre kapağı)doğan352235
FACS tüpleri (beyaz kapak)doğan352063
Fetal sığır serumu (FBS)Atlanta BiyolojiS11150 Serisi
GDNF (Yurt İçi Finans SantraliPeproTech Teknolojisi450Stok konsantrasyonu: 10 μg/mL
Geltrex BelediyesiCanlandırıcıA1413202Bodrum membran matrisi; Stok konsantrasyonu: 100x
hPSC'lerThomson ve diğerleri, (1998)WA09
hPSC'lerOh ve ark. (2016)H9-PHOX2B::eGFP
İnsan fibronektini (FN)VWR/Corning47743-654Stok konsantrasyonu: 1 mg/mL
L-glutaminTermo Balıkçı/Gibco25030-081Stok konsantrasyonu: 200 mM
LN tankıÖzel Biyojenik SistemlerV-1500AB
Fare laminin I (LM)Ar-Ge Sistemleri3400-010-01Stok konsantrasyonu: 1 mg/mL
N2 takviyesiThermo Fisher/Yaşam Teknolojileri17502-048Stok konsantrasyonu: 100x
Nörobazal ortamGibco Şirketi21103-049Stok konsantrasyonu: 1x
NGF (İngilizce)PeproTech Teknolojisi450-01Stok konsantrasyonu: 25 μg/mL
Fosfat tamponlu salin (PBS)Gibco (Gibco)14190-136Stok konsantrasyonu: 1x
Poli-L-ornitin hidrobromür (PO)SigmaP3655 SerisiStok konsantrasyonu: 15 mg/mL
Primocin (antibiyotikler)İnvivoGenANTPM1Stok konsantrasyonu: 50 mg/mL
qPCR makinesiBio-Rad LaboratuvarlarıC1000 Dokunmatik
qPCR plakalarıBio-Rad LaboratuvarlarıHSP9601
rekombinant FGF2Ar-Ge Sistemleri233-FB/CFStok konsantrasyonu: 10 μg/mL
Retinoik asitSigmaR2625 SerisiStok konsantrasyonu: 1 mM
SB431542Tocris/Ar-Ge Sistemleri1614Stok konsantrasyonu: 10 mM
Tripan mavisiCorningMT-25-900-CI
Vitronektin (VTN)Thermo Fisher/Yaşam TeknolojileriA14700Stok konsantrasyonu: 0.5 mg/mL
Su banyosuVWR/Corning706308
Y27632Ar-Ge Sistemleri1254Stok konsantrasyonu: 10 mM
(İngilizce) Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi Serisi adet Serisi Serisi Adet Serisi Serisi

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Pluripotent Stem CellsNeural Crest CellsSympathetic Neuron DifferentiationBasement Membrane MatrixSpheroid FormationRetinoic Acid TreatmentNeural Progenitor CellsPeripheral Nervous SystemCell Culture IncubatorEDTA Dissociation

Related Articles