İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Postganglionik Sempatik Nöronların Üretilmesi

Özet

Kaynak: Wu, H. F., et al. Besleyicisiz ve Kimyasal Olarak Tanımlanmış Kültür Koşulları Altında İnsan Pluripotent Kök Hücreleri Kullanılarak Postganglionik Sempatik Nöronların Verimli Farklılaşması. J. Vis. Uzm. (2020).

Bu video, insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) postganglionik sempatik nöronlar oluşturmak için in vitro bir yöntemi göstermektedir. hPSC'ler, bir farklılaşma ortamı kullanılarak bir bazal membran matris desteği üzerinde nöral krest hücrelerine (NCC'ler) farklılaştırılır. NCC'ler daha sonra ayrışır ve başka bir farklılaşma ortamı kullanılarak sferoidler haline getirilir. Son olarak, sferoidler, sempatik bir nöron ortamı kullanılarak postganglionik sempatik nöronlara dönüştürülür.

Protokol

1. Bulaşık kaplama, ortam hazırlama ve hPSC bakımı için kurulum

1. Bulaşık kaplama
   1. Vitronektin (VTN) kaplama
      1. VTN şişelerini tamamen çözülene kadar 37 ° C'lik bir su banyosuna koyun, ardından iyice karıştırın.
      2. 100 mm'lik bir Petri kabı için, 7 mL 1x fosfat tamponlu salini (PBS) 0,5 mg / mL VTN ile karıştırın, tabağa VTN çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin.
   2. Bodrum membran matris kaplama
      1. Bazal membran matrisi şişelerini (Malzeme Tablosuna bakınız) gece boyunca 4 °C'de buz üzerinde çözdürün.
      2. 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğu için, 2 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortam/Besin Karışımı F-12'yi (DMEM/F12) 20 μL 100x bazal membran matrisi ile karıştırın, tabağa bazal membran matris solüsyonu ekleyin, tabağı parafin film ile sarın ve gece boyunca 4 °C'de temiz bir kapta saklayın. Mümkün olduğunca çabuk çalışın. Kaplamalı bulaşıklar 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
   3. Poliornitin (PO)/laminin (LM)/fibronektin (FN) kaplama
      1. İlk gün, 24 oyuklu bir plakanın bir oyuğu için, 15 μg / mL PO'yu 1 mL 1x PBS ile karıştırın, gece boyunca 37 ° C,% 5 CO_2'de inkübe edin. Hem LM hem de FN'yi gece boyunca -20 °C'de çözün ve tamamen çözülene kadar 4 °C'de saklayın.
      2. İkinci gün, PO çözeltisini aspire edin, kuyucukları 2x 1x PBS ile yıkayın, 2 μg / mL LM ve 2 μg / mL FN içeren 1 mL 1x PBS ekleyin ve gece boyunca% 5 CO₂ içinde 37 ° C'de inkübe edin. Bu noktada, LM/FN solüsyonlu çanak, kurumadığı sürece aylarca inkübatörde tutulabilir. Yemeğin kurumasını önlemek için 1x PBS daha ekleyin.
2. Medya hazırlığı
   1. Bir şişe E8 takviyesini gece boyunca 8 °C'de çözerek Essential 4 ortamını (E8) hazırlayın. Takviyeyi 500 mL E8 ortamı ve gerekirse antibiyotiklerle karıştırın.
      not: Çalışan E8 çözeltisi 2 hafta içinde tüketilmelidir.
   2. Toplam 100 mL'lik bir hacim için 90 mL tam E8 ortamını 10 mL dimetil sülfoksit (DMSO) ile karıştırarak hPSC dondurma ortamını hazırlayın. Filtre sterilize eder.
   3. 100 mL esansiyel 6 (E6) ortamını 10 μM SB431542, 1 ng / mL kemik morfogenetik proteini 4 (BMP4), 300 nM CHIR99021 ve 10 μM Y27632 ile toplam 100 mL hacim için karıştırarak 0. günden 1. güne kadar farklılaşma ortamını hazırlayın.
   4. Toplam 100 mL'lik bir hacim için 100 mL E6 ortamını 10 μM SB ve 0.75 μM CHIR99021 ile karıştırarak 2. günden 10. güne kadar farklılaşma ortamını hazırlayın.
   5. Nörobazal ortamı 2 mL B27 (50x), 1 mL N2 (100x), 2 mM L-Glutamat, 3 μM CHIR99021 ve 10 ng / mL fibroblast büyüme faktörü-2 (FGF2) ile karıştırarak toplam 100 mL hacim için 10. günden 14. güne kadar küresel ortamı hazırlayın.
   6. Her besleme için 10. gün ila 14. gün küresel ortama 0,5 μM taze retinoik asit (RA) ekleyerek 14. günden 28. güne kadar olan ortamı sferoid uzun süreli bakım için hazırlayın.
      not: RA'yı her zaman -80 °C'de tutun.
   7. Nörobazal ortamı 2 mL B27 (50x), 1 mL N2 (100x), 2 mM L-glutamat, 25 ng/mL glial hücre hattı kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF), 25 ng/mL beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF), 25 ng/mL sinir büyüme faktörü (NGF), 200 μM askorbik asit ve 0.2 mM dibutiril siklik adenozin monofosfat (dbcAMP) ile toplam 100 mL hacim için karıştırarak SymN olgunlaşma ortamını hazırlayın. Solüsyon 2 hafta içinde kullanılmalıdır. Her beslemeden önce 0.125 μM taze RA ekleyin. Bu çözüm 14. günden (1. seçenek) veya 28. günden (2. seçenek) itibaren kullanılır.
   8. Toplam 100 mL hacim için DMEM'i %2 FBS, 2 mM L-glutamat ve gerekirse antibiyotiklerle karıştırarak floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tamponunu hazırlayın.
3. hPSC bakımı
   1. hPSC'lerin çözülmesi ve saklanması
      1. Bir VTN kaplı 100 mm tabak hazırlayın.
      2. Bir hPSC şişesini doğrudan sıvı nitrojenden çözmek için, şişeyi 37 °C'lik bir su banyosuna koyun ve tüpü çözülene kadar suda dikkatlice sallayın. Çözülmüş hPSC'leri 10 mL 1x PBS içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 4 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
      3. Süpernatanı atın ve tüpe 1 mL E8 ortamı ekleyin. Peleti tamamen yeniden süspanse etmek için birkaç kez pipetleyin ve ardından toplam 10 mL'ye ulaşmak için 9 mL daha E8 ortamı ekleyin.
      4. VTN çözeltisini 100 mm'lik çanaktan aspire edin.
      5. HPSC'leri 100 mm'lik bir tabağa aktarın, hücrelerin tabağa eşit şekilde dağıldığından emin olmak için hafifçe sallayın (yukarı-aşağı ve sola-sağa, daireler halinde değil)
      6. 37 ° C'de,% 5 CO₂ içinde inkübe edin.
      7. Ertesi gün, tüm ortamları aspire edin ve 10 mL E8 ile besleyin.
      8. Önümüzdeki 3-4 gün boyunca her gün bu şekilde besleyin ve ardından bölmeye hazırlanın.
   2. hPSCs
      bölme NOT: Bölünme noktasındaki hPSC'ler %80 ila %90 arasında birleşmiş olmalıdır. Pürüzsüz ve parlak kenarlı büyük koloniler gözlenmelidir. Bununla birlikte, her koloni arasındaki temastan kaçınılmalıdır (Şekil 1B, gün 0 ve Şekil 4B).
      1. Gerektiği gibi VTN kaplı 100 mm'lik tabaklar hazırlayın.
      2. E8'i aspire edin ve 1x PBS ile 1x bölünmesi gereken tabağı yıkayın.
      3. 1x PBS'yi aspire edin ve 4 mL 0.25 M EDTA ekleyin. 37 °C'de 2 dakika inkübe edin, %5 CO₂.
         not: hPSC'ler küçük koloniler halinde bölünmeli/yeniden kaplanmalıdır. Tek hücrelere ayrılmayı önlemek için etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile 2 dakikadan daha uzun süre işlem yapmayın. Hücreler, 2 dakikalık tedaviden sonra hala çanak yüzeyine bağlı olmalıdır.
      4. EDTA'yı aspire edin, 10 mL E8 ortamını bulaşık yüzeyine kuvvetlice pipetleyerek kolonileri ayırın ve tüm ortamı ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpte toplayın.
      5. %80-%90 birleşim noktasındaki hPSC'ler ile kolonileri 1:15-1:20 arasında bölün. Örneğin, hPSC'leri 1:20 oranında 100 mm'lik bir tabağa bölmek için 500 μL E8/hPSC solüsyonu alın ve 9,5 mL taze E8 ortamı ile karıştırın.
      6. VTN kaplı 100 mm tabaklarda plaka hPSC'ler.
         not: Her araştırmacı ve hücre hattı için ideal bölünme oranının bağımsız olarak oluşturulması tavsiye edilir.
   3. hPSC'lerin dondurulması
      1. Bölünmeye hazır 100 mm'lik bir hPSC tabağı için üç kriyovion ve 3,5 mL dondurma ortamı hazırlayın.
         NOT: Ortam ve şişeler kullanıma kadar 4 °C'de veya buz üzerinde tutulmalıdır.
      2. E8'i aspire edin ve bulaşığı 2x 1x PBS ile yıkayın.
      3. 1x PBS'yi aspire edin ve 4 mL 0.25 M EDTA ekleyin, 37 ° C'de 2 dakika,% 5 CO₂.
         içinde inkübe edin NOT: hPSC'ler, bölünecekleri sırada küçük koloniler halinde dondurulmalıdır. Tek hücrelere ayrılmasını önlemek için hücreleri 2 dakikadan daha uzun süre EDTA ile tedavi etmeyin. Hücreler, 2 dakikalık işlemden sonra hala yemeğin yüzeyine bağlı olmalıdır.
      4. EDTA'yı aspire edin, tabağın yüzeyine 10 mL 1x PBS'yi kuvvetlice pipetleyerek kolonileri ayırın ve tüm ortamı ve hücreleri 50 mL'lik bir tüpte toplayın.
      5. 20 mL 1x PBS ekleyin ve kalan EDTA'yı yıkamak için 200 x g'da 4 dakika santrifüjleyin.
      6. Süpernatanı atın ve peleti 3 mL dondurma ortamında yeniden süspanse edin.
      7. hPSC'leri her biri 1 mL olan üç kriyoviyal olarak eşit olarak dağıtın.
      8. Yavaş bir sıcaklık düşüşü sağlamak için kontrollü bir dondurma kutusunda veya strafor bir sandviçte gece boyunca -80 °C'de saklayın ve ardından uzun süreli saklama için sıvı nitrojen tankına aktarın.

>2. Farklılaşmayı başlatmak için hPSC'lerin tohumlanması (0. gün)

NOT: hPSC'ler stabilize edildikten sonra farklılaşmaya hazır olmalıdır (yani, çözüldükten sonra 2-3 kat bölünür). Kolonilerin sağlıklı, pürüzsüz, parlak kenarları ve minimum farklılaşma ile olduğundan emin olun (Şekil 2B).

1. Gerektiği gibi 0. günden bir gün önce bazal membran matris kaplı tabakları (24 kuyulu veya 6 kuyulu tabak) hazırlayın. Farklılaşmanın başlangıcında bulaşıkları RT'ye getirin.
2. Günü gerektiği gibi 0-1 farklılaşma ortamı yapın.
3. E8'i birleşim yerinden aspire edin, hPCS'leri bölmeye hazır olun ve kabı 2x 1x PBS ile yıkayın.
4. 100 mm'lik tabak başına 7 mL 0.25 M EDTA ekleyin, 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 15 dakika
   inkübe edin not: Bu noktada, EDTA tedavisi tek hücrelere dağılacak şekilde uzar.
5. Tüm hPSC'leri pipetleyin (yüzer durumda olmalıdırlar) ve 50 mL'lik bir tüpe aktarın. EDTA'yı seyreltmek için EDTA çözeltisiyle aynı miktarda veya daha fazla 1x PBS ekleyin.
6. 200 x g'da 4 dakika santrifüjleyin.
7. Süpernatanı atın, hücreleri homojenize etmek için 1 mL gün 0-1 farklılaşma ortamı ekleyin ve pipetleyin. Daha fazla ortam ekleyerek takip edin ve ardından hücre çözeltisini hücreleri saymak için ideal bir konsantrasyona seyreltmek için karıştırın.
   not: Hücre çözeltisini aşırı seyreltmeyin. 100 mm'lik bir tabaktan alınan hücreler, başlamak için 5 mL ortamda seyreltilmelidir.
8. Otomatik bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak hücre numarasını sayın.
9. Düşük bir nihai hacimde 125.000 hücre /^cm2'ye ulaşmak için hücre çözeltisini gerektiği gibi seyreltin (ör., 6 oyuklu bir çanak için oyuk başına 2 mL veya 24 oyuklu bir çanak için oyuk başına 500 μL).
   not: Düşük hacim, hücrelerin daha hızlı bağlanmasına yardımcı olur.
10. Kaplanmış tabaklardan tüm bazal membran matris çözeltisini aspire edin ve hücre çözeltisini kuyucuklara yerleştirin.
11. 37 ° C'de,% 5 CO₂ içinde inkübe edin.

3. Nöral krest hücre indüksiyonu (1. günden 10. güne kadar, Şekil 1A)

1. 1. günde, hücreleri 0-1 gün farklılaşma ortamı ile besleyin (6 kuyulu yemek için oyuk başına 3 mL ve 24 kuyulu yemek için oyuk başına 1 mL).
2. 2. günde, hücreleri 2. gün 10 farklılaşma ortamı ile besleyin (6 kuyulu yemek için oyuk başına 3 mL ve 24 kuyulu yemek için oyuk başına 1 mL).
3. Şu andan itibaren, hücreler 10. güne kadar (yani bir sonraki beslenme günü 4. gün olacaktır) gün aşırı beslenmelidir.
   not: 6. günden itibaren NC sırtları tespit edilmelidir (Şekil 1B). Farklılaşmanın gerçekleşip gerçekleşmediğini kontrol etmek için, SOX10/AP2a için boyanabilen ve farklılaşma süresi boyunca işaretleyici gen ekspresyonu için kullanılabilen daha küçük kuyucuklarda (yani 24 kuyucuk) paralel bir farklılaşma kültürünün taşınması tavsiye edilir (Şekil 1B,C).
4. Hücreleri sıralıyorsanız, bölüm 4'e geçin. Aksi takdirde, bölüm 5'e geçin.

4. Nöral krest işaretleyici CD49D için floresanla aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) ve sferoidlerde NC hücrelerini toplama

>NOT: FACS ayıklaması için numuneler buz üzerinde tutulmalı ve boyamadan sonra ayırmaya kadar ışığa maruz bırakılmamalıdır.

1. Hücreler sıralanmışsa FACS tamponunu hazırlayın.
2. 10-14. gün küresel ortamı hazırlayın.
3. 10. günde, ortamı çıkarın ve 1x'i 1x PBS ile yıkayın.
4. 6 oyuklu bir tabak için oyuk başına 2 mL'de veya 24 oyuklu bir tabak için oyuk başına 1 mL'de ayrışma çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve 37 ° C'de,% 5 CO_2'de 20 dakika inkübe edin.
5. Tüm hPSC'leri pipetleyin ve 50 mL'lik bir tüpe aktarın.
6. Tüpün geri kalanını FACS tamponu ile doldurun ve 4 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin
   not: Her 50 mL'lik tüp, 20 mL'ye veya daha az hücre çözeltisi barındırabilir. FACS tamponunun hacmi, ayrışma çözeltisini nötralize edecek kadar yüksek olmalıdır.
7. Süpernatanı atın, hücreleri uygun miktarda FACS tamponu (6 oyuklu bir plakanın oyuğu başına ~ 2 mL) ile yeniden süspanse edin ve hücre sayısını belirlemek için sayın.
8. Aşağıdaki örnekleri hazırlayın.
   1. Örnek 1 (boyanmamış kontrol): 400 μL FACS tamponunda 1 x 10⁶ hücre. Hücreleri 20 μm'lik bir süzgeç kapağından süzün ve tüpü buz üzerinde tutun.
   2. Örnek 2 (yalnızca DAPI kontrolü): 0.5 ug / mL 4 ", 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren 400 μL FACS tamponunda 1 x 10⁶ hücre. Hücreleri süzgeç kapaklı bir FACS tüpünden süzün ve tüpü buz üzerinde tutun.
   3. Örnek 3 (CD49D etiketli): Hücrelerin geri kalanını fikoeritrin/siyanin7 (PE/Cy7) konjuge CD49D antikoru (100 μL FACS tamponu başına 1 x 106 hücre için 5 μL) içeren FACS tamponu ile 15 mL'lik bir tüpte askıya alın ve 20 dakika buz üzerinde inkübe edin.
9. Tüpleri FACS tamponu ile doldurun ve 4 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
10. Süpernatanı atın ve üreticinin talimatlarına göre 0,5 ug/mL DAPI içeren 1 mL FACS tamponunda her 5-10 x^{10 6} hücreyi yeniden süspanse edin.
11. Süzgeç kapağı ile hücreleri FACS tüpünden süzün ve tüpü buz üzerinde tutun.
12. 2 mL FACS tamponu içeren toplama FACS tüplerini hazırlayın.
13. CD49D ⁺ popülasyonunu izole etmek için DAPI ve PE-Cy7'yi tespit edebilen lazerlerle FACS makinesini sıralayın.
14. Sıraladıktan sonra, sıralanan hücreleri sayın.
15. Sıralanan tüm hücreleri santrifüjleyin ve 10-14. gün küresel ortamda, 500 μL ortam başına 0.5 x^{10 6} hücrelik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin.
16. Plaka: 0.5 x 10⁶ hücre, ultra düşük ataşman 24 oyuklu plakalara oyulmuş.
17. Hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO₂ içinde inkübe edin.

5. NC hücrelerinin sferoidlerde toplanması

1. NC hücrelerini izole etmek için FACS kullanmıyorsanız ve bunun yerine bunları doğrudan sferoidler halinde topluyorsanız, önce hücreleri adım 4.2-4.5'te açıklandığı gibi hazırlayın.
2. Tüpün geri kalanını 1x PBS ile doldurun ve 200 x g'da 4 dakika santrifüjleyin.
3. Süpernatanı atın, hücreleri uygun miktarda 10-14 küresel ortamla (örneğin, 6 oyuklu bir plaka için oyuk başına ~ 2 mL ortam) yeniden süspanse edin ve hücre sayısını belirlemek için sayın.
4. Hücreleri 10-14. gün küresel ortamda, 500 μL ortam başına 0.5 x^{10 6} hücreye seyreltin.
5. Plaka: Ultra düşük ataşmanlı 24 oyuklu plakalarda kuyucuk başına 500 μL hücre süspansiyonu.
6. Hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO₂ içinde inkübe edin.

6. NC sferoid bakımı ve sempatik progenitör indüksiyonu (10. gün - 14. gün, Şekil 3A)

1. Seçenek 1: Minimal sferoid kültürü
   1. 11. günde, 10. günden itibaren mevcut ortamı aspire etmeden NC sferoidlerine 500 μL 10-14. gün küresel ortam ekleyin. 37 ° C'de,% 5 CO₂ içinde inkübe edin.
   2. 12. günde, NC sferoidlerini kuyucukların bir tarafında biriktirmek için plakayı eğin. Mümkün olduğu kadar çok besiyerini dikkatlice aspire edin ve atın ve 1 mL gün 10-14 küresel besiyeri ile besleyin.
   3. 14. güne kadar hücreleri her gün beslemeye devam edin.
   4. İsteğe bağlı: Sferoidler toplanır ve büyük bir küme oluşturursa, küresel kümeleri parçalamak için bir pipet kullanın. Bu aynı zamanda bireysel sferoidlerin çok büyük olmamasını sağlar.
      not: İdeal sferoid boyut aralığı 100-500 μm civarında olmalıdır. Bu aralık içinde, tek tek sferoidlerin boyutu kritik değildir. Bununla birlikte, pürüzsüz ve net kenarlar (Şekil 2 ve Şekil 4) gibi morfoloji, daha fazla başarı için önemlidir. 14. günde, her 24 oyuklu plaka ideal olarak yukarıda belirtilen boyut aralığında farklı boyutlarda yaklaşık 50-60 sferoid içerir.
2. Seçenek 2: Genişletilmiş sferoid kültürü
   1. 15. günde, NC sferoidlerini tutmak için, 0.5 μM RA içeren 10-14. günde 1.5 mL küresel ortam ile besleyin. 37 °C'de inkübe edin, %5 CO₂.
      not: RA her beslemede taze olarak eklenmeli ve her zaman -80 °C'de saklanmalıdır.
   2. Şu andan itibaren, 28. güne kadar her gün besleyin ve ardından sferoidlerin kaplanmasına devam edin (bölüm 7.1).
      not: Büyüyen sferoidler, parçalanmaları için 1 mL'lik bir pipetle pipetlenerek haftada yaklaşık 1 kez bölünür. Yaklaşık 1:2–1:4 oranında bölünürler. 2 haftalık genişleme periyodu içinde, hücrelerin sayısı kabaca dört katına çıkmalıdır.

7. Sempatik nöron (SymN) farklılaşması ve olgunlaşması (Seçenek 1: 14. günden sonra; Seçenek 2: 28. günden sonra)

1. Normal yemeklerde kaplama sferoidleri
   1. PO / LM / FM kaplı 24 kuyulu plakaları hazırlayın.
   2. 0.125 μM RA (her beslemede taze ekleyin) ve 10 μM Y27632 (yalnızca 14. gün) içeren symN ortamı hazırlayın.
   3. 14. günde, kuyucukların bir tarafında NC sferoidleri biriktirmek için plakayı eğin. Mümkün olduğu kadar çok ortamı dikkatlice aspire edin ve atın ve 1 mL symN ortamı ile besleyin.
   4. LM/FN'yi kaplanmış plakalardan çıkarın.
   5. Her bir kuyuyu 24 oyuklu plakadan yeni, kaplanmış 24 oyuklu plakanın 4 ayrı oyuğuna bölün ve plakalayın. Her orijinal kuyucuk, ~50-60 sferoid içeren 1 mL'ye sahip olacaktır. Bu, yeni plakadaki her kuyucuk için yaklaşık 10-15 sferoid içeren 250 μL verir.
   6. Kuyucuk başına 250 μL ek ortam ekleyin.
      not: Bu 1:4'lük bir bölünmedir; Sferoidlerin çözelti içinde düzgün bir şekilde dağıtıldığından emin olun, böylece bölünme nispeten eşit olur. Sferoidlerin sayısı sayılmaz çünkü son sayı symN üretme başarısını etkilemez.
   7. 37 ° C'de,% 5 CO_2'de inkübe edin.
   8. 15. günde (veya seçenek 2 için 29. günde), tüm ortamı 0.125 μM RA içeren 1 mL symN ortamı ile değiştirerek besleyin. Şu andan itibaren, nöronlar 20. güne (veya 2. seçenek için 35. güne) kadar her 2 günde bir beslenmelidir.
   9. 20. günden sonra (veya seçenek 2 için 35. gün), nöronlar mevcut ortamın sadece yarısını (500 μL) dikkatlice değiştirerek beslenmelidir. Şu andan itibaren, ortam hızla sararıncaya kadar her hafta besleyin.
   10. İstenilen zaman noktasına kadar haftalık olarak beslemeye devam edin.
       NOT: symN'ler ganglion benzeri yapılarda toplanma eğilimindedir ve kültür çanaklarından ayrılmaya eğilimlidir. Bunu önlemek için, yarım besleme ve minimum kullanım önerilir.

Sonuçlar

Şekil 1: NC indüksiyonu. (A) 0. günden 10. güne kadar NC indüksiyonu için zaman çizelgesi ve tedaviler. (B) NC sırtlarının morfolojisi ve oluşumu her 2 günde bir parlak alan mikroskobu ile izlendi. 2. günden sonraki her zaman noktasındaki hücreler AP2A (kırmızı) ve SOX10 (yeşil) için birlikte boyandı. Tüm immünofloresan resimler DAPI ile boyandı. Kırmızı oklar sırtlar...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
100 mm hücre kültürü kapları	doğan	353003
15 mL konik doku kültürü tüpleri	VWR/Corning	89039-664
24 oyuklu doku kültürü plakaları	doğan	353047
24 kuyulu ultra düşük bağlantı plakaları	Corning	07 200 601 ve 07 200 602
% 5 CO2/20% O2 doku kültürü inkübatörü	Thermo Fisher/Yaşam Teknolojileri	Heracell VIOS 160i
50 ml konik doku kültürü tüpleri	VWR/Corning	89039-656
6 oyuklu doku kültürü plakaları	Yardımcı yıldız	3516
Aktataz	İnovasyon Hücre Teknolojileri	AT104500	Hücre ayrışma çözümü
Anti-AP2a antikoru	Abcam Belediyesi	ab108311	Ev sahibi: Tavşan; 1:400 seyreltme
Anti-Ascl1 antikoru	BD Pharmingen	556604	Ana bilgisayar: Fare IgG1; 1:200 seyreltme
Anti-CD49D antikoru	Biyo Efsane	304313	Ana bilgisayar: Fare IgG1; 100 μl hacimde 5 μl/milyon hücre
Anti-CD49D antikoru (izotip)	Biyo Efsane	400125	Ana bilgisayar: Fare IgG1; 100 μl hacimde 5 μl/milyon hücre
Anti-DAPI antikoru	Sigma	D9542	1:1000 seyreltme
Anti-DBH antikoru	İmmünostar	22806	Ev sahibi: Tavşan; 1:500 seyreltme
Anti-GFP antikoru	Abcam Belediyesi	AB13970	Ev sahibi: Tavuk; 1:1000 seyreltme
Anti-HOXC9 antikoru	Santa Cruz Biyoteknoloji	SC-365692	Ana bilgisayar: Fare IgG1; 1:100 seyreltme
Anti-NET1 antikoru	Memili	NET17-1	Ana bilgisayar: Fare; 1:1000 seyreltme
Anti-PRPH antikoru	Santa Cruz Biyoteknoloji	SC-377093/H0112	Ana bilgisayar: Fare IgG2a; 1:200 seyreltme
Anti-SOX10 antikoru	Abcam Belediyesi	ab50839	Ana bilgisayar: Fare; 1:100 seyreltme
Anti-TH antikoru	Pel-Dondurma	P40101- 150	Ev sahibi: Tavşan; 1:500 seyreltme
Askorbik asit	Sigma	A8960-5G	Stok konsantrasyonu: 100 mM
B27 takviyesi	Thermo Fisher/Yaşam Teknolojileri	12587-010	Stok konsantrasyonu: 50x
BDNF (BDNF)	Ar-Ge Sistemleri	248-BD	Stok konsantrasyonu: 10 μg/mL
BMP4	Ar-Ge Sistemleri	314-BP	Stok konsantrasyonu: 6 mM
Hücre sayacı	Thermo Fisher/Yaşam Teknolojileri	Kontes II
Hücre sayma odası slaytları	Canlandırıcı	C10312
merkezkaç	Eppendorf Belediyesi	57021 ve 5424R
CHIR99021	Ar-Ge Sistemleri	4423	Stok konsantrasyonu: 6 mM
Kriyo-flakon	Thermo Fisher/Yaşam Teknolojileri	375353
dbcAMP	Sigma	D0627	Stok konsantrasyonu: 100 mM
DMEM (Ömer Çiçeğ	Thermo Fisher/Yaşam Teknolojileri	10829-018	Stok konsantrasyonu: 1x
DMEM/F12	Thermo Fisher/Yaşam Teknolojileri	11330-057	Stok konsantrasyonu: 1x
DMSO (Türkçe)	Thermo Fisher/Yaşam Teknolojileri	BP231-100
E6 orta	Gibco Şirketi	A15165-01
E8 orta	Gibco Şirketi	A15169-01	Stok konsantrasyonu: 1x
E8 takviyesi	Gibco Şirketi	A15171-01	Stok konsantrasyonu: 50x
Edta	Sigma	ED2SS	Stok konsantrasyonu: 0,5 M
FACS makinesi	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	CytoFLEX (FACS için)
FACS makinesi	Beckman Coulter'ın fotoğrafı.	MoFlo Astrios EQ (sıralama için)
FACS tüpleri (mavi filtre kapağı)	doğan	352235
FACS tüpleri (beyaz kapak)	doğan	352063
Fetal sığır serumu (FBS)	Atlanta Biyoloji	S11150 Serisi
GDNF (Yurt İçi Finans Santrali	PeproTech Teknolojisi	450	Stok konsantrasyonu: 10 μg/mL
Geltrex Belediyesi	Canlandırıcı	A1413202	Bodrum membran matrisi; Stok konsantrasyonu: 100x
hPSC'ler	Thomson ve diğerleri, (1998)	WA09
hPSC'ler	Oh ve ark. (2016)	H9-PHOX2B::eGFP
İnsan fibronektini (FN)	VWR/Corning	47743-654	Stok konsantrasyonu: 1 mg/mL
L-glutamin	Termo Balıkçı/Gibco	25030-081	Stok konsantrasyonu: 200 mM
LN tankı	Özel Biyojenik Sistemler	V-1500AB
Fare laminin I (LM)	Ar-Ge Sistemleri	3400-010-01	Stok konsantrasyonu: 1 mg/mL
N2 takviyesi	Thermo Fisher/Yaşam Teknolojileri	17502-048	Stok konsantrasyonu: 100x
Nörobazal ortam	Gibco Şirketi	21103-049	Stok konsantrasyonu: 1x
NGF (İngilizce)	PeproTech Teknolojisi	450-01	Stok konsantrasyonu: 25 μg/mL
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Gibco (Gibco)	14190-136	Stok konsantrasyonu: 1x
Poli-L-ornitin hidrobromür (PO)	Sigma	P3655 Serisi	Stok konsantrasyonu: 15 mg/mL
Primocin (antibiyotikler)	İnvivoGen	ANTPM1	Stok konsantrasyonu: 50 mg/mL
qPCR makinesi	Bio-Rad Laboratuvarları	C1000 Dokunmatik
qPCR plakaları	Bio-Rad Laboratuvarları	HSP9601
rekombinant FGF2	Ar-Ge Sistemleri	233-FB/CF	Stok konsantrasyonu: 10 μg/mL
Retinoik asit	Sigma	R2625 Serisi	Stok konsantrasyonu: 1 mM
SB431542	Tocris/Ar-Ge Sistemleri	1614	Stok konsantrasyonu: 10 mM
Tripan mavisi	Corning	MT-25-900-CI
Vitronektin (VTN)	Thermo Fisher/Yaşam Teknolojileri	A14700	Stok konsantrasyonu: 0.5 mg/mL
Su banyosu	VWR/Corning	706308
Y27632	Ar-Ge Sistemleri	1254	Stok konsantrasyonu: 10 mM