$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Hazırlıklar
- 10 ml diseksiyon ortamı hazırlayın ve 9.8 ml Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium F12'sine (DMEM / F12) 200 μl 100x penisilin-streptomisin ekleyin.
- L-Sistein çözeltisi hazırlayın: doku kültürü için 10 ml suya ve 120 mg L-sistein ekleyin. L-sistein çözeltisini 4 ° C'de 2 haftaya kadar veya alikotlarda -20 ° C'de 1 yıla kadar saklayın.
- DNase I çözeltisini hazırlayın: doku kültürü için 1 ml suya 10 mg DNaz I ekleyin. DNase I çözeltisini 2 aya kadar 4 ° C'de saklayın.
- Papain çözeltisini hazırlayın: papain çözeltisini hazırlamak için, 5 mL DMEM / F12'ye 100 μl papain (yaklaşık 140 birim), 100 μl DNaz I (% 1) ve 200 μl L-sistein (12 mg / ml) ekleyin. Papain solüsyonunu her seferinde taze olarak hazırlayın ve kullanmadan önce 0,22 μm gözenek boyutu filtresi ile sterilize edin.
- Yıkama solüsyonu hazırlayın: 100 ml yıkama solüsyonu hazırlamak için, 650 μl glikoz% 45, 500 μL 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit, HEPES 1 M ve 5 ml fetal sığır serumu ekleyin (FBS) 93.85 ml Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS) 1x. Kullanmadan önce yıkama solüsyonunu 0,22 μm gözenek boyutunda bir filtre ile sterilize edin. Yıkama solüsyonunu 4 °C'de 2 aya kadar saklayın.
- İnsülin çözeltisi hazırlayın: 2 ml insülin çözeltisi hazırlamak için, doku kültürü için 2 ml suya 25 μl'lik bir damla 10 N sodyum hidroksit (NaOH) ve 100 mg insülin ekleyin.
- Epidermal büyüme faktörü (EGF) ve fibroblast büyüme faktörü (FGF) çözeltilerini hazırlayın: Her iki mitojeni de 100 μg / ml konsantrasyonda DMEM / F12'de çözün. -20 °C'de 10 μl alikotlar halinde saklayın.
- B-27 ve N-2 ortamını hazırlayın: B-27 ve N-2 takviyelerini -20 °C'de sırasıyla 500 μl ve 1 ml alikotlar olarak saklayın.
- Z-farklılaşma koşulu ortamını hazırlayın: 100 ml Z-farklılaşma koşulu ortamı hazırlamak için 40 μl insülin (50 mg / ml), 500 μl B-27, 1 ml N-2, 650 μl glikoz% 45 ve 1 ml 100 x penisilin-streptomisin ekleyin 97.81 ml DMEM / F12. Kullanmadan önce Z-farklılaşma koşulu ortamını 0,22 μm gözenek boyutunda bir filtre ile sterilize edin. Z farklılaşma koşul ortamını 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
- Z koşulu ortamını hazırlayın: 50 ml Z koşulu ortamı hazırlamak için, 50 ml steril Z farklılaştırma koşulu ortamına (20 ng / ml) 10 μl EGF ve 10 μl FGF ekleyin. Z koşulu ortamını 4 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
- Farklılaşma kültürü için kaplama çözeltisi hazırlayın: 5 ml hücre dışı kaplama çözeltisi için, 100 μl hücre dışı matris çözeltisi ekleyin (ör., Matrigel) 4.9 ml DMEM / F12 içine. Hücre dışı matris çözeltisini buz üzerinde 4 ° C'de çözdürün. Buzu çözüldükten sonra 2 haftaya kadar 4 °C'de tutun.
2. Yetişkin Zebra Balığı Beyninin Diseksiyonu
- 100 mm x 15 mm'lik bir Petri kabını jel buz paketleri ile doldurarak bir diseksiyon yatağı hazırlayın. Ardından kapağı petri kabının üzerine yerleştirin ve jel donana kadar -20 °C'de inkübe edin. Kapağın üstüne bir kare temiz filtre kağıdı yerleştirin ve hem filtre kağıdını hem de petri kabını plastik filmle sarın.
- Tüm mikrodiseksiyon aletlerini her kullanımdan önce %70 etanol veya ısı ile temizleyin ve sterilize edin. Tüm sterilize edilmiş diseksiyon aletlerini diseksiyon mikroskobunun yanına yerleştirin ve ötenaziden hemen önce diseksiyon yatağını fiber optik aydınlatmalı mikroskobun altına yerleştirin.
- Bütün bir beyin nörosfer hazırlığı için 2 yetişkin zebra balığı toplayın; ve disseke beyin bölgelerinden nörosferler oluşturmak için 3 ila 4 zebra balığı.
- Yetişkin zebra balıklarına (8-12 aylık) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan bir protokol kullanarak ötenazi yapın. Daha sonra, balığı 5-10 saniye boyunca% 75 etanole batırın ve hızlı bir şekilde diseksiyon yatağına yerleştirin ve ardından cerrahi bir bıçak kullanarak solungaç seviyesinde dekapitasyon yapın.
- Hayvanları ötenazi yapmak için, hayvanın kalp atışı yavaş yavaş yavaşlayana ve dolaşım durana kadar aşırı dozda (300 mg / L) trikas metan sülfonat uygulayın, ardından buzlu suya batırın.
- Başın sırt tarafını aşağı çevirin ve makası kullanarak kesilen taraftan ağza uzunlamasına bir kesim yapın. Forseps kullanarak kafatasının tabanını açığa çıkarın ve tüm bitişik dokuyu çıkarın. Kafatasının yan duvarlarını omuriliğin başlangıcından tektuma doğru kesin.
- Makası kullanarak, optik sinirleri kesin ve çıkarın ve ardından kafatasının en yan kısmının her iki tarafını da tektum seviyesinde çıkarın. Başın ventral tarafını yukarı çevirin. Forseps kullanarak, kafatasının en apikal kısmının geri kalanını soyun.
- Beyni, kafatasının kalan kısmı ile birlikte diseksiyon ortamı (1.1) ile yeni bir tabağa aktarın. Mikro bıçağın plastik sapını kullanarak diseksiyon ortamındaki beyin dokusunu temizleyin ve tüm beyin yapılarını sağlam tutun.
- Bu noktadan sonra, tüm zebra balığı beynini kullanarak protokole devam edin.
- Alternatif olarak, tüm zebra balığı beyninden veya taze bir neşter ile diseke edilen telensefalon, tektum / diensefalon veya beyincikten nöroküreler oluşturmak için bu protokolü belirli beyin bölgelerine uyarlayın. Şekil 1'e göre ilgilenilen beyin bölgesini incelemek için nöral spesifik bir floresan zebra balığı nöral transgenik hattı kullanın.
3. Yetişkin Beyninin Tek Hücre Ayrışması
- Sonraki tüm çalışmaları bir biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirin. Beyin dokusunu 800 μl diseksiyon ortamı içeren 1.5 ml'lik bir tüpe aktarın (adım 1.1'de hazırlanmıştır). Beyin dokusuna dokunmadan pipetleme yaparak diseksiyon ortamını çıkarın.
- 500 μl papain solüsyonu ekleyin (adım 1.4) ve beyin dokusunu 37 ° C'de 10 dakika boyunca sindirin. Hücre canlılığını azaltabileceğinden 15 dakikadan daha uzun süre kuluçkaya yatırmayın.
- İnkübasyondan sonra, beyin dokusunu 500 μl papain solüsyonu ile alttan ~ 0.25 inçte kesilmiş 1.000 μl'lik bir pipet ucu kullanarak 15 ml'lik konik bir tüpe aktarın. Aynı uçla 10 kez yavaşça yukarı ve aşağı pipetleyerek beyin dokusunu nazikçe ayırın. 15 defadan fazla yukarı ve aşağı pipetleme yapmayın ve hücre canlılığını değiştirebileceğinden bu adım sırasında hava kabarcıkları oluşturmayın.
- Beyin dokusunu 37 ° C'de 10 dakika boyunca tekrar inkübe edin, ardından kesilmemiş 1.000 μl normal uç kullanarak 10-13 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre ölümünü önlemek için 15 defadan fazla yukarı ve aşağı pipetlemeyin.
- 2 ml yıkama solüsyonu (aşama 1.5) ekleyerek enzimatik sindirimi durdurun ve hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice boşaltın ve tüpü bir parmağınızla kuvvetlice vurarak ve ardından 1.000 μl'lik normal bir uçla yukarı ve aşağı pipetleyerek peleti kalan çözelti içinde yeniden süspanse edin. Daha sonra 2 ml yıkama solüsyonu ekleyin.
- Bu aşamada, mikroskop altında tek hücreli bir süspansiyonun elde edilip edilmediğini kontrol edin. Hücre süspansiyonunu RT'de 5 dakika boyunca 800 x g'da tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve 1 ml taze Z-koşul ortamı kullanarak peleti yeniden askıya alın (adım 1.10).
- Tripan mavisi kullanarak hücreleri boyayın ve mavi ölü hücreleri hariç tutarak bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın. Her oyukta 200 μl hücre süspansiyonu ve 300 μl taze Z-koşul ortamı içeren 24 oyuklu bir plaka hazırlayın. ~500 hücre/μl yoğunlukta tohum hücreleri. Zebra balığı beyninden türetilmiş nörosferler 37 °C'de iyi büyümediğinden, kültürlenmiş hücreleri bir inkübatörde %5 CO2'de 30 °C'de tutun.
4. Birincil Nörosferlerin Oluşumu
- 1 gün sonra in vitro (DiV1), yetişkin tüm beyinden elde edilen tek hücreli süspansiyonu mikroskop altında gözlemleyin ve kuyu merkezinde kalıntı birikip birikmediğini not edin. Yaklaşık 100 μl ortam pipetleyerek (mümkünse daha az) kalıntıları dikkatlice temizleyin. Daha sonra 100 μl taze Z koşulu ortamı ekleyin. Bu sırada tek hücreli süspansiyonlar gözlenmelidir (Şekil 2A, DiV1).
- 2 gün sonra in vitro (DiV2), kültürlenmiş hücreleri genişletin. Ucu kesilmiş 1.000 μl'lik bir pipet kullanarak, her bir oyuktan 250 μl hücre süspansiyonu toplayın ve yeni bir kuyuya aktarın. Tüm kuyucuklara 250 μl taze Z koşulu ortamı ekleyin. Kültürlenmiş hücreleri genişletmeden önce, kuyucuk boyunca yukarı ve aşağı pipetleyerek süspansiyonu çok nazikçe homojenize edin.
- Sonraki 4 gün boyunca in vitro (DiV4) 4.1 ve 4.2 adımlarını tekrarlayın. DiV3 ve DiV4'teki kuyunun merkezinde ve kenarlarında nörosferlerin boyutunda ilerleyici bir artış görülmelidir (Şekil 2B ve C).
not: Birincil nörosferler, çoklu potensi değerlendirmek için geçiş veya farklılaşma için işlenebilir. Alternatif olarak, farklılaşma süreci sırasında belirli genlerin rolünü karakterize etmek için nükleofeksiyon veya lipo-transfeksiyon için işlenebilirler.
5. Birincil Nörosferlerin Geçişi
- Her oyuktan 250 μl doku kültürünü çıkarın ve DiV4 nörokürelerini 1 ml'lik bir pipetle mekanik olarak ayırın. Hava kabarcığı oluşumu hücre ölümünü artırabileceğinden çok hızlı bir şekilde yukarı ve aşağı pipetlemeyin.
- Hücreleri bir hemositometre ile sayın ve 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 250 μl primer kültür süpernatanı içinde 800 hücre / μl dağıtın.
- Her oyuğa 250 μl Z koşulu ortamı ekleyin.
- 2 gün sonra in vitro (DiV2), kültürlenmiş hücreleri adım 4.2 ve 4.3'te bildirildiği gibi genişletin.
6. Birincil Nörosferlerin Farklılaşması
- Kapak camlarını 10 dakika boyunca% 70 etanole batırarak sterilize edin, ardından kapak camlarını 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna yerleştirerek RT'de kurutun.
- Kapak camının ortasına, geniş bir şekilde genişleyebilecek ve tüm kapak camını kaplayabilecek şekilde 300 μl hücre dışı kaplama solüsyonu (adım 1.11) ekleyin. Daha sonra 37 °C'de 1 saat inkübe edin (nemlendirilmiş hücre kültürü inkübatörü kullanılarak).
- İnkübasyondan sonra hücre dışı kaplama solüsyonunu çıkarın ve kapak camını 37 ° C'de 2 saat kurutun.
- Her oyuktan 250 μl doku kültürünü çıkarın. 1 ml'lik bir pipetle (daha geniş uçlu olan) tüm DiV4 birincil nörokürelerini kuyu başına yukarı ve aşağı pipetleyerek mekanik olarak ayırın.
- Önceden hazırlanmış hücre dışı matris kaplı örtü camlarında (adım 6.1-6.3) 4 x 103 hücre / ml'lik bir hücre yoğunluğunda ayrışmış nörosfer hücre süspansiyonlarını tohumlayın ve substrata yapışana kadar% 5 CO2 içinde 30 ° C'de en az 30 dakika tutun. Daha sonra, kültür ortamını çıkarın ve hücreleri %5 CO 2 içinde 30 ° C'de 24 saat kültürlemeden önce 1 ml önceden ısıtılmış taze Z-farklılaşma koşulu ortamını (adım 1.9) hızla ekleyin.
- Her iki günde bir, hücre farklılaşması sırasında Z-farklılaşma koşulu ortamının yarısını değiştirin.
