Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Beyin Organoidlerinin Oluşumu (23 gün)
- Nöroektodermin başlatılması (5 gün)
NOT: Farklılaşmaya başlamadan önce aşağıdaki noktalara dikkat edilmelidir. İnsan iPSC'lerini elde etmek için yeniden programlama yöntemi (lentiviral-, sendai-virüs-, epizomal- veya mikroRNA tabanlı vb.) ideal olarak tüm hasta ve kontrol iPSC hatları için aynı olmalıdır. Yayınlanmış protokollere dayalı çeşitli yeniden programlama kitleri ve talimatlar mevcuttur. İnsan iPSC hatlarının kalitesi, optimum bir farklılaşma elde etmenin anahtarıdır. Koloni ve hücre morfolojisini mikroskopla izleyin ve Oct3/4, Nanog veya TRA-1-60 gibi belirteçlerin ekspresyonunu test ederek pluripotensi doğrulayın.
- İnsan iPSC'lerini Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrisi ile kaplanmış bir tabak üzerinde ortam A'da besleyicisiz koşullar altında kültürleyin.
not: Tanımlanmış bir kültür koşulunu korumak ve farklılaşma başlamadan önce fare embriyonik besleyici hücrelerinin (MEF'ler) çıkarılması için ek bir adımdan kaçınmak için insan iPSC'lerini besleyici ve serum içermeyen büyütün. İnsan iPSC'lerin farklılaşmaya başlaması için en uygun geçiş numarası, yeniden programlandıktan sonra 15. pasajdan toplamda 70. pasaja kadar değişir. Geçerken, düşük mekanik strese sahip uygun bir hücre ayırma solüsyonu ve agregaları yeni bir tabağa aktarmak için 2 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak hücreler toplanırken hiPSC kolonilerini ayırın. Çoğu iPSC hattında farklılaşmaya ve apoptoza neden olabileceğinden, tek hücrelere ayrışmayı önleyin. Uzun süreli, tek hücreli geçişin insan iPSC'lerinde genomik değişiklikleri artırabileceği bildirilmiştir. Ayırma çözeltisini çıkarmak için bir santrifüj adımı gerektiren hücre ayırma prosedürlerinden kaçının, çünkü bu, iPSC'lerin genel uygulanabilirliğini azaltır. Tüm kültürleri mikrobiyal kontaminasyonlar, özellikle mikoplazma için düzenli olarak test edin, çünkü bu, iPSC'lerin kalitesini ve farklılaşma kapasitelerini değiştirebilir.
- 60 mm'lik bir doku kültürü kabını, üreticinin talimatlarına göre EHS matrisi ile kaplayın.
- 1 x 106 insan iPSC'den oluşan bir alikotu çözün. iPSC'leri, EHS matrisi ile kaplanmış ve 5 mL ortam A içeren 60 mm'lik bir doku kültürü kabına tohumlayın (Malzeme Tablosuna bakın). Ortamı günlük olarak değiştirin ve hücreler ~% 80 birleşmeye ulaştığında 5 ila 7 gün sonra geçişi değiştirin.
not: Çözülmüş iPSC'leri, farklılaşmaya başlamadan önce en az bir kez, kolonilerin enzim içermeyen ayrılması gibi standart yöntemleri kullanarak% 80 birleşmede geçirin. Kısacası, iPSC ortamını çıkarın, hücreleri önceden ısıtılmış 37 ° C Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium: Besin Karışımı F-12 (DMEM / F12) ile bir kez yıkayın ve iPSC'leri reaktif A kullanarak üreticinin talimatlarını izleyerek inkübe edin (malzeme tablosuna bakın). Tek hücrelere ayrışmayı önlemek için önerilen inkübasyon süresini aşmayın. İnsan iPSC'leri tek hücreler olarak değil, kümeler olarak ayrılmalı ve yüzdürülmelidir. Daha sonra yeni EHS matris kaplı kaplara aktarılabilirler; örneğin, 60 mm'lik bir tabaktan alınan iPSC agregaları 4 yeni 60 mm'lik tabağa dağıtılabilir.
b. Üreticinin talimatlarına göre bir mikoplazma tespit kiti ile mikoplazma olup olmadığını kontrol edin. Mikoplazma iPSC'lerin farklılaşma kabiliyetini değiştirebileceğinden, yalnızca mikoplazma içermeyen iPSC'leri kullanın.
- iPSC'leri ayırın (%80 birleşik) ve reaktif B kullanarak tek hücreli bir süspansiyon hazırlayın
- iPSC'leri önceden ısıtılmış (37 °C) DMEM/F12 ile bir kez yıkayın.
- Önceden ısıtılmış reaktif B ekleyin (örneğin, 60 mm'lik bir tabakta 1 mL) ve iPSC'leri 37 ° C ve% 5 CO2'de 5 dakika inkübe edin.
- iPSC'leri çıkarmak için çanağın yanına ve altına parmak ucunuzla 20 kez hafifçe vurun. Mikroskop altında hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin.
- Hücre süspansiyonunu 1 mL'lik bir mikropipet ile tabakta yukarı ve aşağı 5 kez pipetleyin.
- 1 mL reaktif B'yi seyreltmek için 3 mL ortam A ekleyin ve hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
- iPSC'leri (500 x g) oda sıcaklığında 4 dakika boyunca yavaşça döndürün.
- Hücre peletini 1 mL B ortamında yeniden süspanse edin ve hücre sayısını bir hemositometre ile sayın.
not: Yeniden süspansiyon için yalnızca orta B maddesi kullanmaya dikkat edin. Farklılaşmayı engelleyebilecek çok yüksek konsantrasyonda bFGF içerdiğinden orta A kullanmaktan kaçının.
- Hücre süspansiyonunu, 10 μM rho ile ilişkili protein kinaz inhibitörü (Y-27632) ile takviye edilmiş orta B'de mL başına 4.5 x10 5 hücreye seyreltin.
- Yapışmayan, v tabanlı, 96 oyuklu bir plakaya oyuk başına 100 μL ekleyin.
not: 100 μL'lik porsiyonları çıkarmadan önce tüpü her seferinde sallayarak hücrelerin süspansiyonda eşit olarak dağıldığından emin olun. Boyut ve şekil olarak homojen nörosferler (yuvarlak, tanımlanmış yüzeyler) elde etmek için her oyuğun eşdeğer bir hücre sayısı içermesi önemlidir.
- Hücreleri 500 x g ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca plakayı yavaşça döndürün ve 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- Önümüzdeki 5 gün boyunca her bir oyuğa 50 μL çıkararak ve 50 μL taze ortam B ekleyerek ortamı günlük olarak değiştirin.
2. Nöroküreleri EHS Matrisine Gömme (4 gün)
- Aşağıdakileri karıştırarak nörosfer ortamını hazırlayın: 1: 1 DMEM / F12 ve orta C karışımı (v / v), 1: 200 (h / v) takviye 1, 1: 100 (v / v) takviye 2 (w / o) A Vitamini, 1: 100 L-glutamin, 0.05 mM esansiyel olmayan amino asitler (MEM), 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 1.6 g / L insülin ve 0.05 mM β-merkaptoetanol.
- Daha önce steril makasla kesilmiş ~2 mm'lik bir uç kullanarak 200 μL'lik bir mikropipet ile nörosferleri toplayın.
- Nörosferleri birbirinden yaklaşık 5 mm uzağa, parafin film (3 x 3 cm, 2) üzerine 100 mm'lik boş bir tabağa yerleştirin ve kalan ortamın mümkün olduğunca çoğunu dikkatlice çıkarın.
- Her bir nörosfer üzerine bir damla (7 μL) EHS matrisi ekleyin.
- EHS matris damlalarını bir inkübatörde 15 dakika boyunca nörosferlerle inkübe edin.
- Nörosferleri, nörosfer ortamıyla yıkayarak parafin filminden dikkatlice yıkayın. Yıkamak için 1 mL'lik bir mikropipet ve 10 mL nörosfer ortamı içeren 100 mm'lik yeni bir Petri kabı kullanın.
- Nörosferleri önümüzdeki 4 gün boyunca inkübe edin ve 2.
. günde 2 mL taze nörosfer ortamı ekleyin
not: Kuluçka makinesindeki rafların düz olduğundan emin olun, böylece EHS matrisine gömülü nöroküreler yemeğin bir tarafında bir araya toplanmaz.
3. Döner Süspansiyon Kültüründe Organoidler (14 Gün)
- Aşağıdakileri karıştırarak beyin organoid ortamını hazırlayın: 1: 1 DMEM / F12 ve orta C (v / v) karışımı, 1: 200 (h / v) ek 1, 1: 100 (h / v) ek 2 A vitamini, 1: 100 L-glutamin, 0.05 mM MEM, 100 U / mL penisilin, 100 μg / mL streptomisin, 1.6 g / L insülin, 0.5 μM dorsomorfin, 5 μM SB431542, ve 0.05 mM β-merkaptoetanol.
- Her bir eğirme şişesine yan kollarından 100 mL beyin organoid ortamı ekleyin ve en az 20 dakika ön ısıtma için bir inkübatöre yerleştirin.
- Üreticinin talimatlarına göre 25 rpm'de bir karıştırma programı ayarlayın.
not: EHS matrisine gömülü nöroküreleri döner şişelere aktarmadan önce, hepsinin ayrıldığından emin olun. EHS matrisi ile iki veya daha fazla bağlanmışsa, bağlantı matrisini bir neşterle keserek ayırın.
- EHS matrisine gömülü nöroküreleri, 2 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak 100 mL organoid ortam içeren eğirme şişelerine dikkatlice aktarın. Nörosferleri şişeye aktarmak için döner şişenin yan kollarını kullanın.
- Eğirme şişelerini 37 ° C ve% 5 CO2'de bir inkübatörde manyetik bir karıştırma platformuna yerleştirin; Bu, organoid kültürünün 0. günüdür.
- Ortamın yarısını çıkararak ve aynı miktarda taze ortam ekleyerek ortamı haftada bir kez (veya renk değişikliği olduğunda daha sık sık) değiştirin.
not: Eğirme şişelerini inkübatörden çıkarırken, organoidlerin şişenin dibine çökmesine izin vermek için 3-5 dakika bekleyin. Cam pipet ucunu (bir pompaya bağlı) sıvının yüzeyine yerleştirerek ortamı çıkarın; Ortamı, şişenin bir yan açıklığından/kolundan dikkatlice aspire edin. Bu manipülasyonlar laminer başlık altında yapılmalıdır.
