Nöral Kök ve Progenitör Hücrelerin Elektriksel Stimülasyona Bağlı Farklılaşması

Özet

Kaynak: Chang, H. et al., Mikroakışkan Cihazlarda Elektrik Alan Kaynaklı Nöral Öncü Hücre Farklılaşması.J. Vis. Uzm. (2021)

Bu video, elektriksel stimülasyon yoluyla nöral kök ve progenitör hücreleri veya NPC'leri ayırt etmek için hücre dışı matris kaplı bir mikroakışkan çipin kullanımını göstermektedir. Tohumlandıktan ve kaplanmış bölgeye yapıştıktan sonra, NPC'ler büyür ve doğru akımın uygulanması, nöronlara, astrositlere ve oligodendrositlere farklılaşmalarını tetikler.

Protokol

1. Çok kanallı, optik olarak şeffaf, elektrotaktik (MOE) çipin tasarımı ve imalatı

1. Uygun yazılımı kullanarak tek tek polimetil metakrilat (PMMA) katmanları ve çift taraflı bant için desenler çizin (Şekil 1A, Malzeme Tablosu). Hem PMMA tabakalarını hem de çift taraflı bandı bir CO₂ lazer makinesi çizici ile kesin (Şekil 1B).
   1. CO₂ lazer yazıcıyı açın ve kişisel bir bilgisayara bağlayın. Yazılımı kullanarak tasarlanan desen dosyasını açın.
   2. PMMA levhalarını (275 mm x 400 mm) veya çift taraflı bandı (210 mm x 297 mm) lazer çizicinin platformuna yerleştirin (Şekil 2A). Otomatik odaklama aracını kullanarak lazeri PMMA tabakalarının yüzeyine veya çift taraflı banda odaklayın.
   3. Yazıcı olarak lazer çiziciyi seçin ve ardından PMMA tabakası veya çift taraflı bant üzerinde doğrudan ablasyonu başlatmak ve PMMA tabakası veya bant üzerinde ayrı desenler elde etmek için lazer çiziciyi kullanarak deseni "yazdırın" (Şekil 2B).
2. Koruyucu filmi PMMA tabakalarından çıkarın ve yüzeyi nitrojen gazı kullanarak temizleyin.
   not: PMMA modelinin çizimi ve PMMA levhasının doğrudan işlenmesi, önceki bir rapora göre gerçekleştirildi.
3. Birden fazla PMMA tabakası katmanını birbirine yapıştırmak için, üç parça 1 mm'lik PMMA tabakasını (Katman 1, 2 ve 3) istifleyin ve akış/elektrik stimülasyon kanalı tertibatını oluşturmak için 110 °C'de 30 dakika boyunca bir termal bağlayıcıda 5 kg/^cm2'lik bir basınç altında bağlayın (Şekil 2C).
   not: Ticari olarak elde edilen PMMA levhalarının farklı partileri, biraz farklı cam geçiş sıcaklıklarına (Tg) sahiptir. Optimum yapıştırma sıcaklığının, Tg'ye yakın 5 °C'lik artışlarla test edilmesi gerekir.
4. Hızlı etkili siyanoakrilat yapıştırıcı ile MOE çip düzeneğinin Katman 1'indeki ayrı açıklıklara 12 parça adaptör yapıştırın.
   not: Adaptörler enjeksiyon kalıplama ile PMMA'dan yapılmıştır. Alttaki düz yüzeyler MOE çipine bağlanmak içindir. 1 / 4W-28 dişi vida dişlerine sahip adaptörler, beyaz parmak geçirmez tapaları, düz tabanlı konektörleri veya Luer adaptörlerini bağlamak içindir. Hızlı etkili siyanoakrilat yapıştırıcı kullanırken dikkatli olun. Gözlere sıçramaktan kaçının.
5. Çipi monte etmeden önce 1 mm PMMA alt tabakalarını (Katman 1-3), çift taraflı bandı (Katman 4) ve 3 mm optik sınıf PMMA'yı (Katman 5) ultraviyole (UV) ışınlama kullanarak 30 dakika dezenfekte edin (Şekil 1A).
6. PMMA montajını (Katman 1-3) tamamlamak için 1 mm PMMA alt tabakalarını (Katman 3-3) çift taraflı bantla (Katman 4) 1 mm optik sınıf PMMA'ya (Katman 5) yapıştırın (Şekil 5A).
7. Çip üzerindeki montaj için temiz kapak camını hazırlayın.
   1. Deterjanın on kat seyreltilmesini bir boyama kavanozuna doldurun (Malzeme Tablosuna bakın) ve bu deterjanın içindeki kapak camını ultrasonik bir temizleyici kullanarak 15 dakika boyunca temizleyin.
   2. Deterjanın tüm kalıntılarını gidermek için boyama kavanozunu akan musluk suyu altında iyice durulayın.
   3. Tüm musluk suyu kalıntılarını gidermek için damıtılmış suyla durulamaya devam edin ve adım 1.7.2'yi iki kez tekrarlayın.
   4. Temizlenmiş kapak camını nitrojen gazı ile üfleyerek kurulayın.
8. Çipi monte etmeden önce PMMA düzeneğini (Katman 1-5), çift taraflı bandı (Katman 6) ve kapak camını (Katman 7) bir biyogüvenlik kabini içinde UV ışınlaması kullanarak 30 dakika boyunca dezenfekte edin (Şekil 1A).
9. Temizlenmiş kapak camını (Katman 7) çift taraflı bantla (Katman 1) PMMA düzeneğine (Katman 5-6) yapıştırın (Şekil 1A).
10. MOE çipini gece boyunca bir vakum odasında inkübe edin; sonraki prosedürler için MOE çip düzeneğini kullanın (Şekil 3).

2. Hücre kültürü bölgelerindeki substrat üzerine poli-L-lizin (PLL) kaplanması

1. Politetrafloroetilen tüpü, düz tabanlı konektörü, koni konektörünü, koni-Luer adaptörünü, beyaz parmak geçirmez fişi (durdurucu olarak da adlandırılır), Luer adaptörünü, Luer kilit şırıngasını ve siyah kauçuk kelepçeyi hazırlayın (Şekil 4A, Malzeme Tablosu). Yukarıdaki tüm bileşenleri bir otoklavda 121 °C'de 30 dakika sterilize edin.
2. Agar köprüsü adaptörlerinin açıklıklarını (Şekil 1A) beyaz parmak sıkı tapalarla kapatın. Düz tabanlı konektörü, orta giriş ve çıkış adaptörleri aracılığıyla MOE çip düzeneğine bağlayın (Şekil 4B). Koni-Luer adaptörünü 3 musluklara bağlayın.
3. Orta girişin 3 muslukuna bağlanan 3 mL'lik bir şırınga kullanarak 2 mL% 0.01 PLL çözeltisi ekleyin (Şekil 4B-).
4. Boş bir 3 mL şırıngayı orta çıkışın 3 muslukuna bağlayın (Şekil 4B-).
5. Hücre kültürü bölgelerini PLL çözeltisi ile doldurun. Kaplama çözeltisini manuel olarak yavaşça ileri geri pompalayın. Çözeltiyi kültür bölgelerinin içine sızdırmaz hale getirmek için iki adet 3 vanayı kapatın.
6. MOE çipini %5 CO 2 atmosferi ile doldurulmuş bir inkübatörde gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin.

3. Tuz köprüsü ağının hazırlanması

1. Adım 2.6'yı takiben, iki adet 3 vanayı açın ve iki şırıngayı kullanarak kaplama solüsyonunu kanalda manuel olarak ileri geri pompalayarak kanallardaki kabarcıkları yıkayın.
2. 3 mL tam ortam (Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle's medium/Ham'ın besin karışımı F-12 (DMEM/F12), %2 B-27 takviyesi, 20 ng/mL EGF ve 20 ng/mL bFGF'den oluşan kök hücre bakım ortamı) orta girişin 3 muslukuna bağlanan 3 mL'lik bir şırıngaya çekin (Şekil 4B- ve Şekil 4B- ).
3. Hücre kültürü bölgelerindeki kaplama çözeltisini değiştirmek için 3 mL tam ortam ekleyin. Boş bir 5 mL şırıngayı orta prizin 3 musluğuna bağlayın (Şekil 4B-).
4. Tuz köprüsü ağını hazırlayın (Şekil 5).
   1. Bir boşluk oluşturmak için siyah kauçuk çubuğu kesin ve gümüş (Ag)/gümüş klorür (AgCl) elektrotlarını siyah kauçuk çubuktan geçirin ve Luer kilit şırıngasına yerleştirin (Şekil 4A).
   2. Beyaz sıkı tapayı Luer adaptörüyle değiştirin ve Luer adaptörünü doldurmak için %3 sıcak agaroz enjekte edin.
      not: Sıcak agarozun hazırlanması için, 3 g agaroz tozunu 100 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün ve 121 ° C'de 30 dakika boyunca bir otoklavda sterilize edin.
   3. Luer kilit şırıngasını Luer adaptörüne bağlayın. Şırıngayı iğne ile kullanarak Luer kilit şırıngasını doldurmak için siyah kauçuk çubuktan% 3 sıcak agaroz enjekte edin. Agarozun soğuması ve katılaşması için 10 ila 20 dakika bekleyin.
      not: Agarozun hacim kapasitesini arttırmak için, Luer kilit şırıngası Luer adaptörüne monte edilmiştir (Şekil 4 ve Şekil 5). Daha sonra, büyük elektrotlar Luer kilit şırıngasına yerleştirilir. Elektrot, uzun süreli deney için kararlı bir elektriksel stimülasyon sağlama yeteneğine sahiptir.

>4. mNPC'lerin hazırlanması

1. mNPC'leri tam ortamda% 5 CO₂ atmosferi ile doldurulmuş bir inkübatörde 37 ° C'de 37 ° C'de 25T hücre kültürü şişesinde kültürleyin. Hücreleri her 3-4 günde bir alt kültürleyin ve tüm deneyleri orijinal kaynaktan 3-8 geçiş geçirmiş hücrelerle gerçekleştirin.
2. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve nörosferleri 5 dakika boyunca 100 × g'da döndürün. Süpernatanı aspire edin ve nörosferleri 1x Dulbecco'nun PBS'si (DPBS) ile yıkayın. Nörosferleri 5 dakika boyunca 100 × g'da döndürün.
3. 1x DPBS'yi aspire edin ve ardından nörosferleri tam ortamda yeniden askıya alın. İyice ve yavaşça karıştırın.
4. Çıkışın 3 vanasına bağlanan 1 mL'lik bir şırınga kullanarak 1 mL nörosfer süspansiyonu ekleyin (Şekil 4B-).

5. DC darbe stimülasyonu için mikroakışkan sistemin kurulumu (Şekil 6)

1. Hücre tohumlu MOE çipini, programlanabilir bir XYZ motorlu aşamaya sabitlenmiş şeffaf indiyum-kalay oksit (ITO) ısıtıcıya takın.
   not: ITO yüzey sıcaklığı, oransal-integral-türev bir kontrolör tarafından kontrol edilir ve 37 °C'de tutulur. Çip içindeki hücre kültürü bölgelerinin sıcaklığını izlemek için çip ile ITO ısıtıcı arasına K-tipi bir termokupl sıkıştırılır. MOE çipi, programlanabilir bir XYZ motorlu tablaya monte edilmiştir ve ayrı kanal bölümlerinde otomatik hızlandırılmış görüntü alımı için uygundur. ITO ısıtıcının imalatı ve hücre kültürü ısıtma sisteminin kurulumu daha önce açıklanmıştır.
2. mNPC'leri, orta çıkış üzerinden MOE çipine manuel olarak pompalayarak infüze edin. Hücre tohumlu MOE çipini 37 °C ITO ısıtıcıda 4 saat inkübe edin.
3. 4 saat sonra, bir şırınga pompası kullanarak 20 μL/s'lik bir akış hızında ortam girişi üzerinden tüm ortamı MOE çipinden pompalayın.
   not: mNPC'ler, hücre bağlanmasına ve büyümesine izin vermek için elektrik alanları (EF) stimülasyonundan önce 24 saat daha çip içinde büyütülür ve tutulur. Atık sıvı, Şekil 5A'da "atık" olarak gösterilen, prizin 3 vanasına bağlı boş bir 6 mL şırıngada toplanır. MOE mikroakışkan sistem konfigürasyonu Şekil 6'da gösterilmiştir. Bu mikroakışkan sistem, hücrelere sürekli bir besin kaynağı sağlar. Taze ortamın tamamı, sabit bir pH değerini korumak için sürekli olarak MOE çipine pompalanır. Bu nedenle, hücreler bir CO₂ inkübatörü dışında kültürlenebilir.
4. Çip üzerindeki Ag/AgCl elektrotları aracılığıyla MOE çipine bir EF çoklayıcıyı bağlamak için elektrik kablolarını kullanın. P görev döngülerinde (P zaman açık ve P zaman kapalı) 100 Hz frekansında 300 mV/mm büyüklüğünde kare dalga DC darbeleri çıkarmak için bir EF çoklayıcı ve bir fonksiyon üretecini bir amplifikatöre bağlayın (Şekil 6B).
   1. Elektrik kablolarını EF çoklayıcıya bağlayın. Elektrik kablolarını Ag/AgCl elektrotları aracılığıyla MOE çipine bağlayın.
   2. EF çoklayıcıyı amplifikatöre bağlayın elektrik kablolarını kullanarak. Fonksiyon üretecini amplifikatöre ve dijital osiloskopa bağlayın.
      not: EF çoklayıcı, devredeki kültür odasının empedansını içeren ve tüm ayrı odaları paralel bir elektronik ağda birbirine bağlayan bir devredir. Üç kültür odasının her biri, çoklayıcıdaki değişken bir dirence (Vr) ve bir ampermetreye (Şekil 6A'da μA olarak gösterilmiştir) seri olarak elektriksel olarak bağlanır. Her bir kültür odasından geçen elektrik akımı, Vr kontrol edilerek değiştirilir ve akım, ilgili ampermetrede gösterilir. Her hücre kültürü bölgesindeki elektrik alan kuvveti Ohm Yasası ile hesaplandı, I= σEA, burada I elektrik akımıdır, σ (DMEM/F12 için 1.38 S·^m-1 olarak ayarlanmıştır) kültür ortamının elektriksel iletkenliğidir, E elektrik alanıdır ve A elektrotaktik odanın kesit alanıdır. Şekil 1'de

Sonuçlar

Şekil 1: Çok kanallı optik olarak şeffaf elektrotaktik çipin ayrıntılı konfigürasyonu.(A) MOE çip düzeneğinin patlatılmış görünümü. MOE çipi, PMMA levhaları (50 mm x 25 mm x 1 mm), çift taraflı bant (50 mm x 25 mm x 0,07 mm), adaptörler (10 mm x 10 mm x 6 mm), optik sınıf PMMA levhası (50 mm x 75 mm x 3 mm), çift taraflı bant (24 mm x 60 mm x 0,07 mm), ve bir kapak camı (24 mm × 60 m...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1 mm PMMA yüzeyleri (Katmanlar 1-3)	Bht	K2R20	Polimetil metakrilat (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 mL plastik tüp	Protech Teknoloji Enterprise Co, Ltd	CT-15-PL-TW	Kapaklı konik tabanlı tüp, monte edilmiş, önceden sterilize edilmiş
3 mL şırınga	TERUMO	DVR-3413	3 mL oral şırınga, iğnesiz
3 mm optik sınıf PMMA (Katman 5)	CHI MEI Şirketi	ACRYPOLY PMMA Sayfası	Optik sınıf PMMA
3 musluk	NIPRO (NIPRO)	NCN-3L (Kuzey Kıbrıs Türk Cumhuriyeti)	Steril tek kullanımlık 3 musluk
5 mL şırınga	TERUMO	DVR-3410	5 mL oral şırınga, iğnesiz
Adaptör	Dong Zhong Co., Ltd.	Özel -leştirilmiş	PMMA adaptörü
agaroz	Sigma-Aldrich	A9414	Agaroz, düşük jelleşme sıcaklığı
yükselteç	A.A. Laboratuvar Sistemleri Ltd.	A-304	Yüksek gerilim amplifikatörü
AutoCAD yazılımı	Autodesk (Otomobil Masası)	Eğitim Versiyonu	Hazırlanması
B-27 takviyesi	Gibco (Gibco)	12587-010	B-27 takviyesi (50x), eksi A vitamini
Temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF)	Peprotech teknolojisi	AF-100-18B	Rekombinant insan FGF-basic olarak da adlandırılır
Siyah kauçuk böğürtlen	TERUMO	DVR-3413	3 mL'den itibaren oral şırıngalar, iğnesiz
Sığır serum albümini (BSA)	Sigma-Aldrich	B4287	Bloke edici reaktif
merkezkaç	HAYSİR	CV2060	merkezkaç
CO2 lazer yazıcı	Lazer Araçları ve Teknikleri A.Ş.	ILS-II	http://www.lttcorp.com/index.htm'dan satın alındı
Koni konektörü	IDEX Sağlık ve Bilim	F-120X	Tek parça parmak geçirmez 10-32 koni, 1/16 "OD doğal için
Cone-Luer adaptörü	IDEX Sağlık ve Bilim	P-659	Luer Adaptörü 10-32 Dişi - Dişi Luer, PEEK
Konfokal floresan mikroskobu	Leica Mikro Sistemler	TCS SP5	Leica TCS SP5 kullanım kılavuzu, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
Dijital fotoğraf makinesi	Olympus	E-330	Otomatik zaman atlamalı görüntü yakalama
Dijital osiloskop	Tektronix	TDS2024	Genlik ve frekansı görüntülemek için bir elektronik devrede veya bileşende zaman içindeki voltaj veya akım sinyallerini ölçün.
Çift taraflı bant	3 milyon	EVCİL HAYVAN 8018	http://en.thd.com.tw/'dan satın alındı
Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle'ın orta/Jambon'un besin karışımı F-12 (DMEM/F12)	Gibco (Gibco)	12400024	DMEM/F-12, toz, HEPES
Dulbecco'nun fosfat tamponlu tuzlu su (DPBS)	Gibco (Gibco)	21600010	DPBS, toz, kalsiyum yok, magnezyum yok
EF çoklayıcı	Asya Gökyüzü Co., Ltd.	Özel -leştirilmiş	Bireysel kanallardaki elektrik akımını izleyin ve kontrol edin
Epidermal büyüme faktörü (EGF)	Peprotech teknolojisi	AF-100-15	Rekombinant insan EGF olarak da adlandırılır
Hızlı etkili siyanoakrilat yapıştırıcı	3 milyon	7004T	Mukavemet anında yapıştırıcı (sıvı)
Düz tabanlı konektör	IDEX Sağlık ve Bilim	P-206	Flanşsız erkek somun Delrin, 1/4-28 düz tabanlı, 1/16" OD mavi için
Fonksiyon üreteci	Agilent Teknolojileri	33120bir	Dahili rasgele dalga biçimi özelliğine sahip yüksek performanslı 15 MHz sentezlenmiş fonksiyon üreteci
İndiyum-kalay-oksit (ITO) cam	Merck	300739	ITO ısıtıcı için
K tipi termokupl	Tecpel Teknolojisi	TPK-02A Serisi	Sıcaklık termokuplları
Luer adaptörü	IDEX Sağlık ve Bilim	P618-01 Serisi	Luer adaptörü dişi Luer 1 / 4-28 erkek polipropilen
Luer kilit şırınga	TERUMO	DVR-3413	Agar tuz köprüleri için
Fosfat tamponlu salin (PBS)	Temel yaşam	BL2651	Yıkama çözeltisi
Poli-L-Lizin (PLL)	Sigma	P4707	Kaplama çözeltisi
Hassas kapak camları kalınlığı No. 1.5H	MARIENFELD BELEDIYESI	107242	https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Programlanabilir X-Y-Z motorlu tabla	Tanlian A.Ş	Özel -leştirilmiş	http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm'dan satın alındı
Oransal-integral-türev (PID) denetleyicisi	Toho Elektronik	TTM-J4-R-AB	Sıcaklık kontrolörü
PTFE tüp	Profesyonel Plastik A.Ş. Tayvan Şubesi	Dış çap 1/16 İnç	Beyaz yarı saydam PTFE boru
Şırınga pompası	Yeni Çağ Sistemleri A.Ş.	NE-1000	NE-1000 programlanabilir tek şırınga pompası
TFD4 deterjan	FRANKLAB (FRANKLAB)	TFD4	Kapak cam temizleyici
Termal bağlayıcı	Kuan-MIN Teknoloji A.Ş.	Özel -leştirilmiş	http://kmtco.com.tw/'dan satın alındı
Ultrasonik temizleyici	Leo	LEO-300S	Ultrasonik steri-temizleyici
Vakum odası	DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.	DOV-30	Vakumlu kurutma fırını
Beyaz parmak geçirmez fiş	IDEX Sağlık ve Bilim	P-316	1/4-28 Düz Tabanlı, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html