$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
Şekil 1, bu protokolün iş akışının şematik bir genel bakışını göstermektedir.
>1. iPSC yeniden programlama ve bakım
- Deneğin kanının 8 mL'sini (yaşlı veya hasta hastası; 65 yaş ve üstü) sodyum sitrat içeren hücre hazırlama tüplerine (CPT) veya etilendiamintetraasetik asit (EDTA) veya heparinize tüplere toplayın.
- Sadece periferik kan içeren ve serum içermeyen peletleri toplamak için oda sıcaklığında (RT) 30 dakika boyunca 1.800 x g'da santrifüjleyin.
- iPSC'leri elde etmek için üreticinin protokolüne göre özel yeniden programlama vektörleri kullanın (Malzeme Tablosuna bakın).
- Besleyici içermeyen, laktoz dehidrojenaz yükseltici virüs (LDEV) içermeyen indirgenmiş büyüme faktörü bazal membran matrisi kaplı 6 oyuklu kültür plakalarında kültür iPSC'leri Esansiyel 8 (E8) ortamında (Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'de% 5 CO2 ile.
- Aşırı kalabalıklaşmayı veya kendiliğinden farklılaşmayı önlemek için iPSC'leri E8 ortamında 3-4 gün koruyun.
- İmmünofloresan belirteçler kullanarak iPSC çizgilerinin pluripotensini doğrulayın (adım 2) ve mikoplazmayı test edin (adım 3).
2. Pluripotent boyama
- Çözeltileri ve antikorları korumak için, hücreleri analizden 3-4 gün önce kaplanmış (adım 1.4) 24 oyuklu kültür plakalarına tohumlayın. Ortamı bir pipetle aspire edin ve hücreleri %4 formaldehit ile fosfat tamponlu salin (1x PBS) içinde RT'de 15-20 dakika sabitleyin.
- Hücreleri 3x 1x PBS ile yıkayın ve PBS'de% 1 sığır serum albümini (BSA) içinde% 0.1 Triton-X 100 ile en az 15 dakika, ancak RT'de en fazla 1 saat geçirgen hale getirin.
- 3x'i 1x PBS ile yıkayın ve RT'de 30 dakika boyunca PBS'de% 5 BSA ile bloke edin.
- 1x PBS ile tekrar 3x yıkayın ve Sox2 ve Oct3/4 antikorlarını (1:100 seyreltme; Malzeme Tablosuna bakınız) ve nükleik leke DAPI'yi gece boyunca %1 BSA'da (1:4.000 seyreltme) ekleyin. Işıktan korumak için alüminyum folyoya sarın.
- 3x'i 1x PBS ile yıkayın ve hücreleri PBS'de bırakın. 10-20x büyütmede floresan mikroskobu ile görüntü. Pluripotens belirteçleri cinsiyet belirleyici bölge Y-box 2 (Sox2) ve oktamer bağlayıcı transkripsiyon faktörü 3/4'ün (Oct3/4) hücrelerin çekirdeğinde lokalize olduğundan emin olun.
3. Mikoplazma testi
NOT: Ayrıntılı tahlil yürütme ve analiz adımları için tespit kitinin protokolüne (Malzeme Tablosuna bakın) bakın. Tespit kiti, mikoplazma testi için reaktif, substrat ve tahlil tamponu sağlar.
- Hücreleri veya canlandırıcı ortamı geçirmeden önce, bir santrifüj tüpünde 2-3 mL hücre kültürü ortamı toplayın ve RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'da herhangi bir hücre veya döküntüyü pelet haline getirin. Süpernatanı 4 ° C'de ≤5 gün saklayın. Algılanabilir bir sinyal sağlamak için hücreleri ortamla en az 24 saat inkübe edin.
- Yeni bir tüpe veya beyaz duvarlı 96 oyuklu bir plakanın kuyusuna 100 μL hücre süpernatantı ekleyin (opak alt kısım önerilir, Malzeme Tablosuna bakınız). Reaktifi ve substratı tahlil tamponunda yeniden oluşturun ve RT'de 15 dakika dengeleyin.
- Numuneye 100 μL reaktif ekleyin ve RT'de 5 dakika inkübe edin. Lüminesansı bir luminometre ile ölçün (ölçüm #1).
- Numuneye 100 μL substrat ekleyin ve RT'de 10 dakika inkübe edin. Lüminesansı ölçün (ölçüm #2).
- Mikoplazma kontaminasyonunu #2 ila #1 ölçüm oranı ile belirleyin. Sonuçların yorumlanması için kitin kılavuzuna bakın.
4. Mikrofilament hazırlama
- Poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA, bkz. Malzeme Tablosu) mikrofilamentlerinin hazırlanmasına, sütür zincirini bir neşterin künt ucuyla yıpratarak başlayın. Yıpranmış elyafı %70 etanol ile hafifçe püskürtün.
- Mikroskop altında ve bir cetvel kullanarak PLGA fiberini 500 μm ila 1 mm uzunluğunda şeritler halinde kesmeye başlayın. Toplamda yaklaşık 25 mm elyaf kesin. Filamentleri 1 mL antibiyotik-antimikotik solüsyon ile 15 mL'lik bir tüpte tutun.
- Davlumbazda, lif çözeltisini 10 mL DMEM / F-12 ile seyreltin (Tablo 1). Çözeltiyi karıştırmak için iyice girdaplayın.
not: Steril bir ortamda bir hücre kültürü akış başlığında çalışın.
- 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarını oluşturan üç embriyoid cisimciğe (EB) 20 μL lif çözeltisi ekleyin. Parlak alan mikroskobu altında, kuyucuk başına lifleri sayın ve ortalamasını alın. Kuyu başına ortalama 5-10 PLGA mikrofilamentine seyreltin veya konsantre edin. Her kuyuyu bu şekilde hazırlayın.
- Kuyular artık hücrelerle tohumlanmaya hazırdır. Plakayı ihtiyaç duyulana kadar oda sıcaklığında veya ertesi gün 4 °C'de saklayın.
5. Embriyoid Cisim (EB) oluşumu
>NOT: Tüm ortamlar ve çözeltiler RT'ye ısıtılmalıdır.
- iPSC'ler %70-80 birleşme noktasına ulaştığında (Şekil 2A), EB oluşumu için geçilmeye ve kullanılmaya hazırdırlar. Hücreleri 10x-20x büyütmede mikroskopla kontrol edin. Kolonilerin minimum (%<10) spontan farklılaşma alanları gösterdiğinden emin olun.
- Ortamı bir pipetle aspire edin ve hücreleri Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ile bir kez yıkayın. 500 μL hücre ayırma çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) veya 0.5 mM EDTA ekleyerek kolonileri ayırın ve 37 ° C'de 3-5 dakika inkübe edin.
not: Steril bir ortamda bir hücre kültürü akış başlığında çalışın.
- Her oyuğa 1 mL taze E8 ortamı ekleyerek salınan hücreleri toplayın ve tüm hücreler ayrılana kadar hafifçe pipetleyin.
- 1.5 mL hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve toplam 2.5 mL hacme ulaşmak için 1 mL daha taze E8 ortamı ekleyin.
- RT'de 3 dakika boyunca 290 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı bir pipetle aspire edin, hücre peletini 50 μM Rho ile ilişkili protein kinaz (ROCK) inhibitörü ile desteklenmiş 1 mL Esansiyel 6 (E6, Malzeme Tablosuna bakınız) ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın.
- İstenen tohumlama yoğunluğuna bağlı olarak 60.000-90.000 hücre/mL'lik bir hücre süspansiyonunu 50 μM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş E6 ortamında hazırlayın (bkz.
- 96 oyuklu ultra düşük bağlantı (ULA) plakasının (veya hazırlanmış bir içbükey plakanın) her bir oyuğuna 150 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Tohum: Kuyucuk başına 9.000-11.000 hücre.
- Hücreleri RT'de 1 dakika boyunca 290 x g'da kuvvet toplamak için plakayı santrifüjleyin. Plakayı% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de inkübatöre yerleştirin.
>6. Nöroepitelyal indüksiyon
- 24 saat sonra, 120 μL ortamı bir pipetle dikkatlice aspire edin. Pipet ucunu kuyuya çok fazla indirerek EB'yi aspire etmediğinizden emin olun.
- 2 μM XAV939 ve Dekapentaplejik (SMAD) inhibitörlerine karşı Annelerin Baskılayıcısı ile desteklenmiş 150 μL E6 ortamı (RT'de) ekleyin: kuyucuk başına 10 μM SB431542 ve 500 nM LDN 193189 (bkz.
- 2 μM XAV939, 10 μM SB431542 ve 500 nM LDN 193189.
ile desteklenmiş taze hazırlanmış E6 ortamı ile ortamı günlük olarak değiştirin
not: 6. günde (DIV6), EB'lerin çapı 550-600 μm olmalı ve daha fazla farklılaşmaya hazır olmalıdır.
7. Organoid farklılaşma ve olgunlaşma
>NOT: Tüm ortamların RT'ye ısıtılması gerekir.
- Yaklaşık DIV7'de, tüm EB'lerin 550-600 μm çapa ulaşıp ulaşmadığını kontrol edin ve pürüzsüz ve net bir kenar gösterin (Şekil 2B); bu aşamada, hücre dışı bir matrise (ECM) gömülmeye hazırdırlar.
not: Steril bir ortamda çalışın.
- Boş bir P4 kutusuna bir film tabakası (yaklaşık 200 inç uzunluğunda) yerleştirerek termoplastik sızdırmazlık filminden (Malzeme Tablosuna bakın) çukurlu gömme tabakaları hazırlayın. 15 mL'lik bir konik tüp veya 500 μL'lik bir mikrosantrifüj tüpü kullanarak, 12 çukur yapmak için film tabakasını deliklere hafifçe bastırın. Film tabakasına %70 etanol püskürtün ve UV ışığı açıkken en az 30 dakika boyunca akış başlığının içinde kurumasını bekleyin.
- Yeterli miktarda bazal membran matrisini (Matrigel, Malzeme Tablosuna bakınız) buz üzerinde çözdürün ve akış davlumbazının içine yerleştirin.
not: EB başına yaklaşık 30 μL seyreltilmemiş membran matrisine ihtiyaç vardır. Jelleşmesini önlemek için membran matrisini her zaman 4 °C'nin altında tutun. Pipetleme sırasında matrisin uçta polimerleşmesini yavaşlattığı ve böylece malzeme kaybını azalttığı için önceden soğutulmuş pipet uçları da önerilir.
- Geniş delikli bir P200 ucu kullanarak, her çukura bir EB aktarın ve normal bir pipet ucuyla mümkün olduğunca fazla ortamı çıkarın. EB'lerin kurumasına izin vermemeye dikkat edin. Düzenli bir P200 ucu kullanarak, her organoide ~ 30 μL seyreltilmemiş membran matrisi ekleyin ve EB'nin damlacığın merkezinde olduğundan emin olun.
- Tüm EB'ler matrise gömüldükten sonra, EB'leri içeren film tabakasını steril bir Petri kabına yerleştirin.
not: İsteğe bağlı olarak, steril su ile doldurulmuş küçük bir Petri kabı, buharlaşmayı önlemek için film tabakasının yanındaki daha büyük Petri kabına yerleştirilebilir.
- Çanağı bir inkübatöre aktarın ve membran matrisinin katılaşmasına izin vermek için% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde yaklaşık 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Her 12 gömülü organoid seti için, ULA 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğunda A vitamini içermeyen B27 ile 5 mL farklılaşma ortamı hazırlayın (Tablo 1). Plakayı bir inkübatörde 37 °C'ye ısıtın.
- İnkübasyon süresi bittiğinde, film tabakasını alarak ve çukurları tabakanın arkasından dışarı iterek gömülü EB'leri ULA 6 oyuklu plakaya aktarın. Gerekirse, kuyudan 1 mL alın ve damlacıkların filmden ayrılmasına yardımcı olmak için tabakaya pipetleyin.
not: Gömmeden 1 gün sonra önemli morfolojik değişiklikler görülebilir; EB'ler düz kenarlara sahip olmaktan tomurcuklar oluşturan şişkin çıkıntılara kadar gider (Şekil 2C).
- 2 gün sonra (DIV9), yarım medya değişikliği yapın. İşlem sırasında membran matris damlacıklarını aspire etmemeye veya zarar vermemeye dikkat edin.
- 2 gün daha sonra (DIV11), ortamı 3 μM CHIR99021 ile destekleyerek tam bir ortam değişikliği yapın (bkz. Malzeme Tablosu).
- DIV14'te, organoid boyutunda kademeli bir artış için ortamı A vitamini ile B27 ile farklılaşma ortamına değiştirin (Tablo 1).
- DIV16'da, kuyu plakasını bir inkübatörün içinde 90 rpm'de bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Medyayı 2 günde bir değiştirin.
- Her 40 DIV'de, ortamdaki ek besinler için her 50 mL ortam için 500 μL membran matrisini seyreltin.
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan farklılaşma ortamının bileşimi.
Serisi
| reaktif | Son Konsantrasyon | Hacim (toplam 50 mL) |
| DMEM-F12 | %50 | 25 mL |
| Nörobazal Orta | %50 | 25 mL |
| N2 Takviyesi (100x) | 1 katı | 0.25 mL |
| B27 Takviyesi -/+ A Vitamini (50x) | 0,5 kat | 0,5 mL |
| Insülin | %0,25 | 12,5 μL |
| GlutaMAX (100x) | 1 katı | 0,5 mL |
| MEM-NEAA (100 kat) | 0,5 kat | 0.25 mL |
| HEPES (1 M) | 10 milyon | 0,5 mL |
| Antibiyotik/Antimikotik (100x) | 1 katı | 0,5 mL |
| 2-β-merkaptoetanol | 50 μM | 17,5 μL |
| NOT: bazı DMEM-F12'ler zaten GlutaMAX içerir, ek eklemeye gerek yoktur. |
