Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir ve steril olarak kullanılmalıdır. Aksi belirtilmedikçe, ortam kullanılmadan önce oda sıcaklığına (RT) ısıtılmalıdır. Ko-kültür protokolüne genel bir bakış için lütfen Şekil 1'e bakın.
1. Motor nöron progenitörlerinin indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) farklılaşması
- 10. gün nöral progenitör (NPC) durumuna ulaşana kadar önceki bir çalışmadan uyarlanan motor nöron farklılaşma protokolünü takip edin. Protokolün zaman çerçevesine göre, farklılaşma Pazartesi günü (0. gün) başlatılır ve bu da Perşembe günü 10. gün NPC'leri ile sonuçlanır.
- Flakon başına 2 x 106-4 x 106 hücre yoğunluğunda% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile nakavt serum replasmanında 10. gün NPC'leri dondurarak saklayın.
Dikkat: DMSO zehirlidir: kişisel koruyucu ekipmanla çeker ocakta tutun.
NOT: Gün 10 NPC'nin yaklaşık %50'sinin çözüldüğünde hayati önem taşıması beklenmektedir. Bu '10. gün NPC' durumunda motor nöron farklılaşma protokolünü durdurun ve NPC'leri daha sonra bankaya yatırılabilen ve kullanılabilen çok sayıda NPC oluşturmak için dondurarak saklayın, bu da ko-kültür protokolünün genel zaman çizelgesinin uzunluğunu 28 günden 19 güne düşürür.
2. İnsan mezoanjiyoblastının (MAB'ler) türetilmesi ve bakımı
>NOT: MAB'ler, bu durumda 58 yaşındaki sağlıklı bir donörden elde edilen biyopsilerden toplanan damarla ilişkili mezenkimal kök hücrelerdir. Alternatif ticari kaynaklar mevcuttur. MAB elde etmek için protokol kısaca açıklanmıştır. Daha fazla bilgi için ayrıntılı protokole bakın. Tüm MAB ortamları kullanılmadan önce 37 °C'ye ısıtılmalıdır.
- Biyopsi dokusunu kıyın ve kollajen (dana derisinden) kaplı 6 cm'lik tabaklar üzerinde bir büyüme ortamında (Tablo 1) 2 hafta boyunca inkübe edin. Ortamı her 4 günde bir değiştirin.
- Kollajen kaplamayı hazırlamak için 100 mg kollajeni 20 mL 0.1 M Asetik asit içinde çözün. Kollajenin çözünmesi zaman alır, bu nedenle karışımı gece boyunca RT'de sallanan bir platforma yerleştirin. Ertesi gün, 100 mL'lik son hacme 80 mL ddH2O ekleyin.
Dikkat: Asetik asit toksiktir; Kişisel koruyucu ekipmanla birlikte bir çeker ocakta tutun.
not: Dana derisi kaplamasından elde edilen kolajen 5 kata kadar tekrar kullanılabilir. 4 °C'de saklayın.
- Tabağın veya şişenin tüm yüzeyini kollajen ile kaplayın, kapatın ve laminer bir akış içinde RT'de 20 dakika inkübe edin. 20 dakika sonra, kollajeni taze bir kapta geri kazanın, boş kabı / şişeyi kapatın ve laminer akışta RT'de 10 dakika bekletin.
- Kabı/şişeyi gece boyunca (veya en az 6 saat) inkübasyon (37 °C,% 5 CO2) için inkübatöre aktarın. Hücreleri kaplamadan önce Dulbecco'nun kalsiyum veya magnezyum (DPBS) içermeyen fosfat tamponlu tuzlu su ile 5 kez yıkayın.
- 14 gün sonra, FACS (floresan aktive edilmiş hücre sıralama), MAB'leri insan alkalin fosfataz için sıralar ve ardından daha fazla genişleme izler. MAB'leri kollajen kaplı T75 şişelerinde büyüme ortamında tutun ve büyüme ortamını her 2 günde bir değiştirin (şişe başına 10 mL).
- %70 birleşmeye ulaştığında cihazlarda kriyoprezervasyon, geçiş veya tohum MAB'leri.
not: MAB'ler, hücreden hücreye temas üzerine spontan füzyonlar nedeniyle miyojenik potansiyellerini kaybederler. MAB'leri genişletirken %70 birleşmeyi aşmadığınızdan emin olun. Bir %70 birleşik T75 şişesi, flakon başına 100.000 hücrede kriyoprezerve edilebilen yaklaşık 600.000-800.000 hücre içerir. Her flakon daha sonra çözülebilir ve genişleme için bir T75 şişesinde tohumlanabilir.
- MAB'leri geçmek için, bunları 7 mL DPBS ile bir kez nazikçe yıkayın ve ardından hücreleri ayırmak için% 5 CO2 içinde 37 ° C'de 3 dakika boyunca 7 mL MAB ayrışma solüsyonunda inkübe edin.
- MAB ayrışma çözeltisini 7 mL büyüme ortamı ile nötralize edin, hücreleri nazikçe kazıyın ve hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın. Potansiyel olarak kalan MAB'leri toplamak için şişeyi fazladan 5 mL büyüme ortamı ile nazikçe yıkayın.
- Hücre süspansiyonunu 300 x g'da 3 dakika santrifüjleyin, daha sonra genişleme için doğrudan yeni bir kollajen kaplı T75 şişesine geçirin, %10 DMSO ile nakavt serum replasmanında kriyoprezervasyon yapın veya mikroakışkan bir cihazda tohum sayımı.
NOT: Maksimum 13 geçiş sayısına kadar hücre genişlemesi için geçişler haftada 1x-2x yapılır. Ayrışma üzerine, MAB'ler mikroskop altında incelendiğinde küresel ve büyük şekilli görünür.
3. Önceden monte edilmiş mikroakışkan cihazların hazırlanması - Gün 9
>NOT: Protokol, mikroakışkan cihaz üreticisinin nöron cihaz protokolünden uyarlanmıştır ve hem önceden monte edilmiş hem de silikon cihazların kullanımı için ayarlanmıştır. Burada, immünositokimya (ICC) ve canlı hücre kalsiyum geçici kayıtları için önceden monte edilmiş cihazlar kullanılırken, taramalı elektron mikroskobu (SEM) için silikon cihazlar kullanılır. Protokolün zaman çizelgesi, motor nöron farklılaşma protokolünün zaman çizelgesini takip eder.
- Kaplamanın gece boyunca inkübe edilmesi gerektiğinden, mikroakışkan cihazları hücreleri tohumlamadan bir gün önce hazırlayın. Motor nöron protokolüne göre, bu bir Çarşamba olacak. 10 cm'lik bir Petri kabına ~ 10 mL %70-100 etanol ekleyin. Cihazı sterilizasyon için nakliye konteynerinden Petri kabına aktarmak için forseps kullanın.
- Cihazı 10 saniye boyunca etanole batırın ve cihazı forseps ile laminer akışta ~ 30 dakika kuruması için bir kağıt parçasına aktarın. Her iki tarafın da kurumasını sağlamak için cihazı birkaç kez çevirin. Cihaz kuruduğunda, kolay kullanım için her cihazı ayrı bir 10 cm'lik Petri kabına taşımak için forseps kullanın.
Dikkat: Etanol toksiktir; Kişisel koruyucu ekipmanlı bir çeker ocakta tutun
- Cihazı DPBS'de Poli-L-ornitin (PLO) (100 μg/mL) ile kaplayın ve 37 °C'de, %5CO2'de 3 saat inkübe edin.
- DPBS'ye 200 μL PLO eklemek için bir P100 pipeti kullanın ve mümkün olduğunca kanal açıklığına yakın bir üst kuyuya ve üst kuyudan kanaldan alt kuyuya geçen sıvıyı gözlemleyin. Daha sonra, DPBS'de 100 μL FKÖ'yü alt kuyuya ekleyin.
- Mikro olukların diğer tarafında tekrarlayın ve mikro olukları kaplamak için cihazın iki aynalı tarafı arasında bir hacim gradyanı oluşturmak için cihazın bir tarafına 100 μL ekleyerek bitirin (örneğin, sağ taraf 200 μL, sol taraf 300 μL). 3 saat sonra, cihazı DPBS ile 3x 5 dakika boyunca yıkayın. Gerekirse bir emme sistemi kullanın.
not: Hücrelerin kaplanması veya kültürlenmesi sırasında herhangi bir noktada kanallarda herhangi bir hava kabarcığı oluşumundan kaçındığınızdan emin olun. Küçük kabarcıklar bile kısa bir süre içinde genişleyecek ve böylece kanal boyunca kaplama, hücre tohumlaması veya ortam akışını engelleyecektir. Kaplama sırasında sıvı kanalda durursa, PLO çözeltisini her iki taraftan doğrudan kanala yeniden süspanse edin. Kabarcıklar hala mevcutsa, kanalı yıkamak için 200 μL DPBS kullanın ve kaplama işlemini yukarıda adım 3.3.1-3.3.2'de belirtildiği gibi tekrarlayın. Hücre tohumlamasından sonra kabarcıklar ortaya çıkarsa, kanalın yıkanması hücrelere zarar vereceğinden cihazı kurtarmak imkansızdır.
- Cihazı bir Nörobazal ortamda laminin (20 μg/mL) ile kaplayın ve gece boyunca 37 °C, %5 CO2'de inkübe edin. FKÖ kaplama için 3.3.1-3.3.2 adımlarındaki talimatların aynısını izleyin.
- Ertesi gün, bir P200 pipeti kullanın ve laminin kaplamayı kuyucuklardan çıkarmak için ucu kanal açıklığının karşısındaki kuyuya yerleştirin. Tüm kuyucuklara DPBS ekleyin ve hücre tohumlaması için DPBS'li cihazları RT'de laminer akışta bırakın.
NOT: Bu noktadan sonra, hava kabarcığı oluşumuna neden olabileceğinden, sıvının (laminin kaplama, DPBS, ortam, fiksasyon solüsyonu vb.) doğrudan kanallardan çıkarılmaması önemlidir. Hücreleri tohumlamadan önce cihazları daima mikroskop altında inceleyin.
4. Mikroakışkan cihazlarda NPC'lerin kaplanması - Gün 10
NOT: Motor nöron farklılaşma protokolüne göre, 10. gün NPC'lerinin kaplanması Perşembe günü gerçekleşir.
- ROCK inhibitörü (10 μL / mL) çözeltisi ile taze ayrışmış 10. gün 10 NPC'leri kullanın veya 10. gün 10 motor nöron ortamının (Tablo 2 ve Tablo 3) başına 1-2 şişe bankalı NPC'yi çözün ve hücre süspansiyonunu 4 dakika boyunca 100 x g'da santrifüjleyin.
- Hücre peletini ROCK inhibitörü (10 μL / mL) çözeltisi ile 500-1000 μL 10 gün motor nöron ortamında yeniden süspanse edin ve tercih edilen herhangi bir sayma yöntemini kullanarak canlı hücreleri sayın.
not: Aşağıda belirtildiği gibi, optimum tohumlama hacmini karşılamak için NPC'leri doğru miktarda ortama yeniden askıya aldığınızdan emin olun.
- Bir P200 pipeti ile cihazdaki mikro olukların bir tarafındaki iki kuyudan DPBS'yi çıkarın ve 60-100 μL 10 motor nöron ortamında cihaz başına 250.000 NPC tohumlayın.
- Sağ üst kuyucuğa, 30-50 μL hücre süspansiyonunu (125.000 hücre) 45°'lik bir açıyla kanal açıklığına yakın bir şekilde tohumlayın ve kalan sıvıyı pipet ucu ile kuyu tabanı boyunca kuyu ortasına doğru nazikçe sürükleyin.
- Bunu alt kuyucukta tekrarlamadan önce hücre süspansiyonunun kanaldan akmasına izin vermek için birkaç saniye duraklayın (30-50 μL'de 125.000 hücre). Cihazın mikroskop olmadan kolay yönlendirilmesi için tohumlanmış tarafı "NPC" veya eşdeğerini işaretlemek için bir kalem kullanın.
- Cihazı 37 °C'de,% 5 CO2'de 5 dakika inkübe edin, böylece iki tohumlu kuyucukları ek bir gün 10 motor nöron ortamı (toplam 200 μL / kuyu) ile doldurun ve 37 ° C'de,% 5 CO2.
not: Her kuyucuk 200 μL içerebilir. Hem kuyucuklarda hem de kanallarda hücrelerin tohumlanması, kültürün sağlam bir yapısını sağlayarak ortam değişiklikleri sırasında hücre ayrılması riskini azaltır. Sadece kanalda daha az hücre tohumlamak mümkündür. Bununla birlikte, bu, kültürü her ortam değişikliği sırasında kanallardan geçen hacim akımına daha duyarlı hale getirecektir.
- Taze tohumlanmış NPC'lerin karşısındaki mikro olukların diğer tarafındaki iki kuyudan DPBS'yi çıkarmak için bir P200 pipeti kullanın. 10. gün motor nöron ortamından 200 μL / kuyu ekleyin ve ortamın kanaldan akmasına izin vermek için üst ve alt kuyu arasında birkaç saniye bekleyin. Ardından, inkübasyon sırasında ortamın buharlaşmasını önlemek için cihazın etrafına 10 cm'lik bir tabak başına 6 mL DPBS ekleyin.
not: Gerekirse, kültür süresi boyunca cihazın etrafına ek DPBS ekleyin.
- 11. gün (Cuma), 14. gün (Pazartesi) ve 16. gün (Çarşamba) günü cihazın her iki bölmesinde tam motor nöron ortamı değişikliği gerçekleştirin (Tablo 2 ve Tablo 3). Orta değişimin olduğu gün taze medya takviyeleri ekleyin.
not: Bu noktadan sonra, tüm ortam değişikliklerini bir P200 pipeti ile gerçekleştirin. Pipet ucunu her zaman kuyunun kenarındaki kanaldan uzağa yerleştirin ve sıvıyı doğrudan kanaldan çıkarmayın. Silikon cihazları sökmemeye dikkat edin. Hücre ayrılmasını önlemek için ortamın çıkarılması ve eklenmesi yavaş yapılmalıdır.
- P200 pipet ucunu kanal açıklığının karşısındaki kuyu duvarının alt kenarına yerleştirerek NPC'li her iki kuyucuğundaki tüm ortamları dikkatlice çıkarın. P200 pipet ucunu kanal açıklığının karşısındaki kuyu duvarının üst kenarına yerleştirerek üst kuyucuğa yavaşça 50-100 μL taze motor nöron ortamı ekleyin.
- Alt kuyucuğa 50-100 μL motor nöron ortamı eklemeden önce ortamın kanaldan akmasına izin vermek için birkaç saniye duraklayın. Her iki kuyucuk da 200 μL/kuyucuk içerene kadar bu işlemi dikkatlice tekrarlayın. Hücresiz tarafta tekrarlayın.
5. Mikroakışkan cihazlarda MAB kaplaması - Gün 17
- Mikroakışkan cihazlarda MAB'lerin tohumlanmasından yaklaşık 7 gün önce (motor nöron farklılaşmasının 10. günü), MAB'leri çözün ve yeterli hücre genişlemesine izin vermek için kollajen ile kaplanmış bir T75 şişesinde büyüme ortamında (Tablo 1) tohumlayın. Bölüm 2'ye bakın.
- Motor nöron farklılaşmasının 17. gününde (Perşembe), MAB'leri adım 2.4'te açıklandığı gibi ayırın, hücre peletini ~ 500 μL büyüme ortamında yeniden süspanse edin ve tercih edilen herhangi bir sayma yöntemini kullanarak canlı hücreleri sayın.
not: Aşağıda belirtildiği gibi, optimum tohumlama hacmini karşılamak için MAB'leri doğru miktarda ortama yeniden askıya aldığınızdan emin olun.
- Cihazdaki mikro olukların tohumlanmamış tarafındaki motor nöron ortamını bir P200 pipeti ile çıkarın, DPBS ile nazikçe yıkayın ve 60-100 μL büyüme ortamında cihaz başına 200.000 MAB tohumlayın.
- Sağ üst kuyuda, 30-50 μL hücre süspansiyonunu (100.000 hücre) kanal açıklığına 45°'lik bir açıyla yakın bir şekilde tohumlayın ve kalan sıvıyı pipet ucu ile kuyu tabanı boyunca kuyu ortasına doğru nazikçe sürükleyin. Alt kuyucukta tekrarlamadan önce hücrelerin kanaldan akışına izin vermek için birkaç saniye bekleyin (30-50 μL'de 100.000 hücre).
- Cihazı 37 ° C'de,% 5 CO2'de 5 dakika inkübe edin, böylece iki taze MAB tohumlu kuyucuğu ek büyüme ortamı (toplam 200 μL / kuyu) ile doldurun. 37 °C, %5 CO2'de tekrar inkübe edin.
NOT: Cihazın motor nöron tarafında 17. günde orta düzeyde bir değişikliğe gerek yoktur. Daha önce yayınlanan motor nöron farklılaşma yöntemine göre 17. gün orta değişim bunun yerine 18. günde (Cuma) gerçekleştirilir.
>6. Motor nöron nöritlerinin MAB bölmesine doğru büyümesini teşvik etmek için hacimsel ve kemotaktik bir gradyanın uygulanması
- 18. günde, 18. gün motor nöron ortamı (200 μL / kuyu) ile motor nöron tarafında tam bir orta değişim gerçekleştirin. Adım 4.5.1-4.5.2'de belirtilen orta değişiklikler için talimatları izleyin. Cihazın MAB bölmesinde MAB farklılaşmasını başlatın (Tablo 2 ve Tablo 4).
- 0.01 μg/mL insan agrini (200 μL/kuyu) ile desteklenmiş önceden ısıtılmış MAB farklılaşma ortamını (Tablo 4) eklemeden önce MAB bölmelerini DPBS ile bir kez dikkatlice yıkayın.
not: MAB'ler bir haftalık süre boyunca birleşecek ve çok çekirdekli miyotüpler oluşturacaktır.
- 21. günde, motor nöron farklılaşma protokolüne göre (Pazartesi), kemotaktik ve hacimsel gradyanı başlatın (Tablo 2 ve Tablo 3).
- 30 ng/mL beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF), glial hücre hattından türetilmiş nörotrofik faktör (GDNF) ve siliyer nörotrofik faktör (CNTF), insan agrini (0.01 μg/mL) ve laminin (20 μg/mL) ile 200 μL/kuyu motor nöron bazal ortamı ekleyin. Motor nöron bölmesine büyüme faktörleri olmadan motor nöron bazal ortamı (100 μL/kuyu) ekleyin.
Tablo 1: MAB büyüme ortamı.Medium, 4 ° C'de 2 hafta dayanabilir. bFGF, kullanım gününde taze olarak eklenir.
Sertifikası
| reaktif | Stok konsantrasyonu | Son konsantrasyon |
| IMDM | 1 katı | %80 |
| Fetal sığır serumu | | %15 |
| Penisilin / Streptomisin | 5000 U/mL | %0,5 |
| L-glutamin | 50 katı | %1 |
| Sodyum piruvat | 100 milyon | %1 |
| Esansiyel olmayan amino asitler | 100 katı | %1 |
| İnsülin transferrin selenyum | 100 katı | %1 |
| bFGF (taze eklenmiş) | 50 μg/mL | 5 ng/mL |
Tablo 2: Motor nöron bazal ortamı.Ortam 4 °C'de 4 hafta dayanabilir.
Serisi
| reaktif | Stok konsantrasyonu | Son konsantrasyon |
| DMEM/F12 | | %50 |
| Nörobazal ortam | | %50 |
| Penisilin / Streptomisin | 5000 U/mL | %1 |
| L-glutamin | 50 katı | 0,5 % |
| N-2 takviyesi | 100 katı | %1 |
| A vitamini içermeyen B-27 | 50 katı | %2 |
| β-merkaptoetanol | 50 milyon | %0,1 |
| Askorbik asit | 200 μM | 0,5 μM |
Tablo 3: Motor nöron ortamı takviyeleri.Takviyeler, motor nöron bazal ortamına kullanım gününde taze olarak eklenir.
)
)
)
)
)
)
| gün | reaktif | Stok konsantrasyonu | Son konsantrasyon | kompartıman |
| Gün 10/11 | Düzleştirilmiş agonist | 10 milyon | 500 deniz mili | her ikisi |
| Retinoik asit | 1 milyon | 0,1 μM | |
| DAPT (DALDIRMA | 100 milyon | 10 μM |
| BDNF (BDNF) | 0.1 mg / mL | 10 ng/mL |
| GDNF (Yurt İçi Finans Santrali | 0.1 mg / mL | 10 ng/mL |
| Gün 14 | DAPT (DALDIRMA | 100 milyon | 20 μM | her ikisi |
| BDNF (BDNF) | 0.1 mg / mL | 10 ng/mL | |
| GDNF (Yurt İçi Finans Santrali | 0.1 mg / mL | 10 ng/mL |
| Gün 16 | DAPT (DALDIRMA | 100 milyon | 20 μM | her ikisi |
| BDNF (BDNF) | 0.1 mg / mL | 10 ng/mL | |
| GDNF (Yurt İçi Finans Santrali | 0.1 mg / mL | 10 ng/mL |
| CNTF (İngilizce | 0.1 mg / mL | 10 ng/mL |
| Gün 18 | BDNF (BDNF) | 0.1 mg / mL | 10 ng/mL | Motor nöron |
| GDNF (Yurt İçi Finans Santrali | 0.1 mg / mL | 10 ng/mL | |
| CNTF (İngilizce | 0.1 mg / mL | 10 ng/mL |
| Gün 21+ | BDNF (BDNF) | 0.1 mg / mL | 30 ng/mL | Myotube (Myotube) |
| GDNF (Yurt İçi Finans Santrali | 0.1 mg / mL | 30 ng/mL | |
| CNTF (İngilizce | 0.1 mg / mL | 30 ng/mL |
| Agrin Belediyesi | 50 μg/mL | 0,01 μg/mL |
| Laminin | 1 mg / mL | 20 μg/mL |
| 21. Gün+ | Takviye yok | | | Motor nöron |
Tablo 4: MAB farklılaşma ortamı.Medium, 4 ° C'de 2 hafta dayanabilir. Agrin kullanım gününde taze olarak eklenir.
Serisi
| gün | reaktif | Stok konsantrasyonu | Son konsantrasyon | kompartıman |
| Gün 18 | DMEM/F12 | | %97 | MAB |
| Sodyum piruvat | 100 milyon | %1 |
| At serumu | | %2 |
| Agrin Belediyesi | 50 μg/mL | 0,01 μg/mL |
