Mikro elektrot dizilerine bağlı üç boyutlu nöronal ağlar oluşturma

Özet

Kaynak: Tedesco, M., et al., 3D Mühendislik Nöronal Kültürlerin Mikro-Elektrot Dizilerine Arayüzlenmesi: Yenilikçi Bir İn Vitro Deneysel Model. J. Vis. Deneyim (2015)

Bu video, hipokampal nöronlara sahip düzlemsel bir mikroelektrot dizisine bağlı bir 3D nöronal kültürün gelişimini göstermektedir. İzole edilmiş nöronlar, mikroelektrot dizisinin aktif alanı üzerinde 2 boyutlu bir ağ oluşturur ve bir zar eki olan çok kuyulu bir plakada cam mikro boncuklara yapışır. Bu nöron kaplı mikro boncukları elektroda aktardıktan sonra, birbirine bağlı bir 3D sinir ağı halinde düzenlenirler.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

>1. Embriyoların Diseksiyonu ve Doku Disosuyasyonu

1. Yetişkin dişi sıçanları (200-250 g) sabit sıcaklıkta (22 ± 1 °C) ve bağıl nemde (%50) düzenli bir aydınlık-karanlık programında (sabah 7 ile akşam 7 arası) hayvan tesisinde barındırın. Yiyecek ve suyun serbestçe bulunabileceğinden emin olun.
2. Hamile bir dişi sıçanı 18 günlük gelişimden (E18) sonra% 3 izofluran kullanarak uyuşturun. Daha sonra hayvanı rahim ağzı çıkığı ile kurban edin.
3. Her sıçan embriyosundan hipokampusu çıkarın ve bunları Ca^{2 +} ve Mg^{2 +} içermeyen buz gibi Hank'in dengeli tuz çözeltisine yerleştirin. Gelişimin 18. gününde, hipokampus ve korteks dokuları çok yumuşaktır ve küçük parçalara kesilmesine gerek yoktur. Daha fazla ayrıntı bulunabilir.
4. Dokuyu 37 ° C'de 18-20 dakika boyunca% 0.05 DNAse içeren Tripsin / Hank çözeltisinin% 0.125'inde ayırın.
5. Süpernatan çözeltiyi bir Pasteur pipeti ile çıkarın ve 5 dakika boyunca% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren ortam ekleyerek enzimatik sindirimi durdurun.
6. Ortamı FBS ile çıkarın ve takviyesi,% 1 L-glutamin, gentamisin 10 μg / ml ile bir kez yıkayın. Ortamı bir Pasteur pipeti ile tekrar çıkarın ve takviyesi,% 1 L-glutamin, gentamisin 10 μg / ml ile birlikte az miktarda (500 μl) büyüme ortamı ile tekrar doldurun.
7. Süt kıvamında bir hücre süspansiyonu görünene kadar doku peletini dar bir Pasteur pipeti ile mekanik olarak ayırın. Hücre süspansiyonunu santrifüjlemek gerekli değildir.
8. 2.0 ml'lik bir nihai hacim elde etmek için küçük hacimli hücre süspansiyonunu büyüme ortamı ile seyreltin. Elde edilen hücresel konsantrasyonu bir hemositometre odası ile sayın. İstenilen 600-700 hücre / μl hücre konsantrasyonunu elde etmek için bu konsantrasyonu 1: 5'te seyreltin.

2. Hücre Kaplama

1. Yaklaşık 2.000 hücre/^mm2 yoğunluğundaki plaka hücreleri, bir 2D nöronal ağ oluşturmak için PDMS kısıtlaması ile tanımlanan, MEA'nın aktif alanı üzerine yerleştirin.
   not: Her hipokampus yaklaşık 5 x 10⁵ hücre içerir (tek bir embriyo için 1 x 10⁶). 2 ml'de toplam 6 x 10⁶ hücre ve tahmini 3.000 hücre / μl konsantrasyon elde etmek için 6 embriyoyu inceleyin. İstenilen hücre konsantrasyonunu elde etmek ve yaklaşık 600-700 hücre / μl plakalamak için bu konsantrasyonu 1: 5'te seyreltin. PDMS kısıtlaması ile sınırlandırılan MEA alanı yaklaşık 7.065^mm2 ve toplam kaplanmış hücre sayısı 600 hücre/μl x 24 μl = 14.400 hücre ise, nihai yoğunluk 2.038 hücre/^mm2 dir.
2. MEA cihazlarını 37 °C'de nemlendirilmiş CO₂ atmosferi (%5) ile inkübatöre yerleştirin.
3. 600-700 hücre/μl (yaklaşık 100.000 hücre) hücre konsantrasyonuna sahip 160 μl süspansiyonu, üç boyutlu kültür oluşturmak için ön adımı tamamlamak için çok kuyulu plakaların içine yerleştirilmiş mikro boncuk tek tabakasının yüzeyine dağıtın. Çok kuyulu plakaları 37 ° C'de nemlendirilmiş CO₂ atmosferi (% 5) ile inkübatöre koyun.

>3. 3D Nöronal Ağ Yapısı

1. Kaplamadan 6-8 saat sonra, süspansiyonu (nöronlu mikro boncuklar) çok kuyulu plakalardan, yaklaşık 30-40 μl'lik bir hacim için bir pipet seti kullanarak PDMS kısıtlaması ile sınırlandırılan alanın içine çok dikkatli bir şekilde aktarın. Her aktarımdan sonra, mikro boncukların altıgen kompakt bir yapıda kendi kendine bir araya gelmesine izin vermek için yaklaşık yarım dakika bekleyin.
2. Tüm katmanlar biriktirildikten ve kendiliğinden bir araya getirildikten sonra, PDMS kısıtlaması ile sınırlandırılan alanın üst kısmını yaklaşık 300 μl ortamdan oluşan büyük bir damla ile yeniden doldurun.
3. MEA'ya bağlı 3D yapıyı, takviyesi ile birlikte son bir hacim (yaklaşık 1 ml) büyüme ortamı kültürü eklemeden önce 48 saat boyunca inkübatöre (T = 37.0 °C, CO₂ =% 5) koyun.
   not: Membran ekli çok kuyulu plakalardaki toplam boncuk sayısını (30.000) ve MEA cihazına tek bir katmandaki boncuk sayısını (6.000) düşünün. Ortaya çıkan 3D yapı, 5 kat mikro boncuk ve hücreden oluşur. 3D nöronal ağın geometrik olarak mükemmel olmadığı göz önüne alındığında, ortaya çıkan 3D yapı 5-8 katmandan oluşabilir.
4. Kaplamadan bir gün sonra, ortamın son hacmini (yaklaşık 900 μl) MEA halkasının içine dikkatlice ekleyin. 3D kültürleri nemlendirilmiş bir CO₂ atmosferinde (% 5) 37 ° C'de 4-5 hafta boyunca koruyun. Ortamın yarısını haftada bir kez değiştirin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	0,05 μg/ml
Poli-D-lizin	Sigma-Aldrich	P6407 Serisi	0,05 μg/ml
Tripsin	Gibco (Gibco)	25050-014	Kalsiyum ve magnezyum iyonları olmadan HBSS'de %0,125 oranında seyreltilmiş 1:2
DNAaz	Sigma-Aldrich	D5025	Hanks çözeltisinde% 0.05 seyreltilmiş
Nörobazal	Gibco Canlandırıcı	21103049	Kültür ortamı
B27	Gibco Canlandırıcı	17504044	%2 orta takviyeli
Fetal sığır serumu (FBS)	Sigma-Aldrich	F-2442	%10
Glutamaks-I	Gibco (Gibco)	35050038	0,5 milyon
gentamisin	Sigma-Aldrich	G.1272 Serisi	5mg/litre
Poli-Dimetil-Siloksan (PDMS)	Corning Sigma	481939	Sertleştirici ve polimer
Mikro Elektrot Dizileri	Çok Kanallı Sistemler (MCS)	60MEA200/30-Ti-pr	MEA ile: Elektrot ızgarası 8x8; Elektrot aralığı ve çapı sırasıyla 200 ve 30 μm; İpliksiz plastik halka
Mikro boncuk	Distrilab-Duke Bilimsel	9040	1gr Cam Part.Size Stds 40 μm
Kuyu Taşımacılığı	Yardımcı Sigma	CLS 3413	Membran eklemeli çok kuyulu plakalar (6,5 mm çap, gözenekli 0,4 μm)
Kalsiyum ve magnezyum iyonları içermeyen HBSS	Gibco Canlandırıcı	14175-052
Hanks Tampon Çözeltisi	Sigma	H8264
sıçan	Sprague Dawley	Wistar Sıçan