Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Kortikal Astrositlerin Hazırlanması ve Yetiştirilmesi
>NOT: Nöronlar hazırlanmadan önce astrosit kültürlerinin birleşik tek tabakalara dönüşmesi gerektiğinden, sonraki adımlara geçmeden önce protokolün bu adımlarını en az 7 gün tamamlayın. Primer astrositler, doğum sonrası gün (P) 0-3 civarında fare yavrularından elde edilen karışık glial kültürlerden türetilir. T75 şişesi başına üç beyin (6 korteks) kullanılmalıdır.
- Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM) steril koşullar altında% 10 v / v at serumu ve% 0.1 v / v gentamisin ile destekleyerek astrosit ortamını hazırlayın. Ortamı 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
- 3x T75 şişesini 10 μg/mL poli-D-Lizin (PDL; hücre kültürü dereceli suda) ile 37 ° C'de en az 1 saat boyunca% 6 v / v CO2 varlığında kaplayın. Kaplamadan sonra, bağlanmamış katyonları çıkarmak için şişeleri fosfat tamponlu Salin (PBS) ile iki kez yıkayın ve 9 mL astrosit ortamı ekleyin.
- Beyinlerin hazırlanması için 1x 10 cm Petri kabına 10 mL Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ve 1x 15 mL tüpe 1 mL HBSS ekleyin (kullanılacak beyin sayısından bağımsız olarak). İşlem için bir çift cerrahi makas, 2 ince forseps ve bir dürbünü elinizin altında bulundurun.
- Cerrahi makasla 3 yavrunun kafasını hızlı bir şekilde kesin ve kafaları 10 cm'lik boş bir tabakta toplayın.
- Dürbün altında kortekslerin hazırlanmasını gerçekleştirin. İki ince forseps kullanarak, boyun kısmından başlayarak göz hizasına doğru orta hatta kafatasından sırt derisini çıkarın. Daha sonra, kan damarları olan beyin, kafatasının altında görülebilir.
- Kafayı rostral uçta bir çift forseps ile sabitleyin ve arka uçtan başlayarak kafatasının orta hattını kesin. Daha sonra, beyni ortaya çıkarmak için kafatasının sağ ve sol yarısını kesin.
- Forsepsin ucunu kapatın ve beynin altına ventral olarak yerleştirin. Beyni kafatasından kaldırın ve HBSS dolgulu 10 cm'lik Petri kabına aktarın. Tüm beyinler tabakta toplanana kadar kalan örnekle aynı şekilde devam edin.
- Beyinleri topladıktan sonra, bir makas gibi bir çift forseps kullanarak arka beyni sıkıştırarak kortekslerin ayrılmasıyla başlayın. Bir çift forseps ile iki yarım küre arasında orta hat kesisi yapın. Beyni bir forseps ile dikkatlice sabitleyin ve kortikal yarımlarla sonuçlanmak için ikinci bir forseps kullanarak orta beyni ve koku soğancıklarını kesin.
- Bir kortikal yarıyı bir çift forseps ile sabitleyin ve meninksleri yan kenardan ayırarak ve ardından ikinci bir forseps kullanarak kortikal yüzeyden çekerek hemisferlerden soyun.
- Kortikal yarıyı, yüzeyi tabağa doğru bakacak şekilde çevirin; Bir çift forseps kullanarak hilal şeklindeki hipokampusu dikkatlice inceleyin ve çıkarın. Tek bir korteks taşımak için bir kapalı forseps kullanarak tek korteksleri konik 15 mL'lik tüpe aktarın.
- Tüm korteksleri topladıktan sonra, steril laminer akış başlığına geçin ve kortikal dokunun ayrışması için hazırlıklara başlayın.
- 2 mL'lik bir reaksiyon tüpüne 1 mL DMEM ekleyin ve% 0.1 w / v papain (30 birim) ekleyin. Süspansiyonu, berraklaştırılmış bir çözelti gelişene kadar (yaklaşık 3 dakika) 37 ° C'de bir su banyosunda inkübe edin. 0.24 mg / mL L-sistein ve 20 μg / mL DNAse ekleyin ve hafifçe çalkalayın.
NOT: Sindirim için yaklaşık 1 mL enzim çözeltisine ihtiyaç vardır.
- Kortikal dokuya eklemeden önce 1 mL steril çözelti elde etmek için filtre (0.22 μm gözenek boyutu). Tüpleri 37 ° C'de (yani bir su banyosunda) 30 dakika - 1 saat inkübe edin.
NOT: Adım 1.11 - 1.14 kritiktir ve 15 dakika içinde tamamlanmalıdır.
- Sindirim reaksiyonunu sonlandırmak için 1 mL astrosit ortamı ekleyin ve 1 mL'lik bir pipet kullanarak sindirilmiş dokuyu dikkatlice ezin. Öğütme için, pipet pistonunu yavaşça hareket ettirin, böylece kortikal doku süspansiyonunu aspire edin ve ekstrüde edin.
- Doku tek hücreli bir süspansiyona ayrıldıktan sonra, 5 mL astrosit ortamı ekleyin ve 216 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı elde edilen peletten dikkatlice aspire edin ve hücreleri 1 mL astrosit ortamında yeniden süspanse edin.
- Hücre süspansiyonlarını, 9 mL astrosit ortamı ile doldurulmuş T75 şişelerine ekleyin (bkz. 1.2).
- Hücreleri inkübatörde 37 ° C'de% 6 v / v CO2 varlığında inkübe edin. 4 gün sonra, ilk tam ortam değişimini (10 mL) gerçekleştirin. Daha sonra, kültür ortamını her 2-3 günde bir değiştirin.
- 7 gün sonra, hücrelerin birleşik bir tek tabaka oluşturup oluşturmadığını kontrol edin. Değilse, kültürün tamamen birleştiği elde edilene kadar 2-3 gün daha bekleyin.
NOT: Astrositler büyük, düzleştirilmiş hücre gövdeleri gösterir, şişenin dibinde lokalize olur ve kayda değer hücresel süreçler geliştirmezler. Küçük faz kontrastlı parlak progenitör hücrelerden ve tek tabakanın üstünde bulunan mikrogliadan farklıdırlar.
- Progenitör hücrelerden kurtulmak ve saf bir astrosit kültürü elde etmek için, T75 şişelerini bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve kültürleri O/N 250 rpm'de çalkalayın. CO2'nin buharlaşmasını önlemek için sıcaklığın 37 °C'ye ayarlandığından ve şişenin filtresinin laboratuvar filmi ile kapatıldığından emin olun.
- Ertesi gün, ortamı aspire edin ve artık bölünen hücreleri ortadan kaldırmak için 20 μM sitozin-1-β-D-arabinofuranosid (AraC) ile doldurulmuş 10 mL taze kültür ortamı ekleyin.
NOT: 37 ° C'de inkübatörde 2 - 3 gün boyunca AraC ile inkübasyon,% 6 CO2 saf bir astrosit kültürü ile sonuçlanacaktır.
- Işık mikroskobu altında görsel inceleme ile astrosit kültürlerinin saflığını izleyin. Artık faz kontrastlı parlak progenitör hücreler ve mikroglia hala astrositik tek tabakanın üstünde bulunuyorsa (bkz. adım 1.16), 1.18 ve 1.19.
adımlarını tekrarlayın
NOT: Birleşen ve saf astrosit tek tabakaları, bir sonraki adıma geçmeden önce inkübatörde (37 °C, %6 v/h CO2) 14 güne kadar muhafaza edilebilir. Her 3 günde bir ortamın yarısını değiştirin. Astrositleri toplamayın, dondurmayın ve çözmeyin, çünkü bu hücreler depolama prosedürü boyunca nöronal destekleyici özelliklerini kaybedecektir.
2. Dolaylı Kokültür için Astrositlerin Hazırlanması
NOT: Nöronları hazırlamadan 48 - 72 saat önce, astrositleri hücre kültürü eklerine aktarın. Genel olarak, tek bir T75 şişesi, bir preparatla elde edilen nöronal kültürleri desteklemek için yeterli sayıda hücre sağlar.
- 24 oyuklu plakalara gerektiği kadar kesici uç yerleştirin. Her bir kesici ucu 10 μg/mL PDL (hücre kültürü dereceli suda çözülmüş) ile 37 °C'de yaklaşık 1 saat, %6 v/h CO2 ile kaplayın. İnkübasyondan sonra, ekleri PBS ile iki kez yıkayın. Bu arada, astrositlerin hazırlanmasına devam edin.
NOT: PBS ile doldurulmuş ekler, astrosit hücre süspansiyonu kullanıma hazır olana kadar saklanabilir.
- Astrosit ortamını (AraC ile) aspire edin ve kalıntı serumun çıkarıldığından emin olmak için kültürü bir kez 10 mL PBS ile yıkayın.
- Şişelere 3 mL %0.05 tripsin-EDTA (Etilendiamintetraasetik asit) ekleyin ve hücreleri 37 °C, %6 v/v CO2'de yaklaşık 10 dakika tripsinasyon için inkübe edin.
- Mikroskop kullanarak görsel inceleme yaparak hücre ayrılmasını kontrol edin ve şişelerin yan tarafını masaüstüne vurarak hücrelerin ayrılmasını kolaylaştırın.
NOT: Adım 2.5 - 2.8 kritiktir ve 15 - 20 dakika içinde bitirilmelidir.
- Tripsinizasyonun ardından, hücreleri 7 mL astrosit ortamında nazikçe yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpe aktarın. 216 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücre peletini 1 mL astrosit ortamında yeniden süspanse edin.
- Bir sayma odası kullanarak hücreleri sayın.
- 24 oyuklu plakanın kuyularının dibini 500 μL astrosit ortamı ile doldurun ve 500 μL astrosit ortamındaki 25.000 hücreyi her bir ek parçaya aktarın. Kültürü 37 °C'de,% 6 v / v CO2'de inkübe edin.
NOT: 42 - 72 saat sonra kültürler yaklaşık% 100 birleşmeye ulaşacaktır. Bu aşamada, kültürün saflığı immünositokimya ile doğrulanabilir. Birleşen kültürler, bir sonraki adıma geçene kadar 7 güne kadar korunabilir. Ortamın yarısını her 3 günde bir değiştirin.
3. Primer Hipokampal Nöronların Hazırlanması
NOT: Birincil fare hipokampal nöronları, zamanlanmış hamile farelerin E15.5 - E16 embriyolarından türetilmelidir.
- Nöron ortamı (10 mM sodyum piruvat içeren MEM, %0.1 w/v ovalbümin, %2 v/v B27 orta takviyesi ve %0.1 v/v gentamisin (steril filtreli)) ve hazırlama ortamı (%0.6 w/v glikoz ve 10mM HEPES ile HBSS (4- (2-hidroksietil) -1-piperazin etansülfonik asit)) hazırlayın. Filtre şişelerindeki nöron ortamını 37 °C, %6 v/v CO2'de önceden ısıtın ve önceden dengeleyin.
- Cam lamellerin (12 mm çapında) 24 oyuklu plakaların kuyucuklarına yerleştirin (hücre kültürü ekleri ile kullanım için çentikli özel lameller kullanın).
- 37 ° C'de suda (hücre kültürü dereceli) 15 μg / mL Poli-DL-Ornitin ile en az 1 saat kaplayın. Lamellerin tamamen kaplandığından emin olmak için kuyu başına en az 500 μL kullanın. Kuyuları PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri kaplayana kadar PBS'yi kuyucuklarda bırakın. Kuyuların kurumamasına dikkat edin.
- Hipokampusu incelemek için, hazırlama ortamı ile doldurulmuş 3x 10 cm'lik tabaklar ve 1 mL hazırlama ortamı ile 1x 2 mL'lik tüp hazırlayın. Makas ve 2 ince forseps hazırlayın.
- Gebe fareyi servikal çıkık ile sakrifiye edin, karnı %70 v/v etanol ile yıkayarak sterilize edin ve keskin bir makas kullanarak karnı açın. Boncuklu uterusu makasla dikkatlice eksize edin ve organı hazırlama ortamı ile doldurulmuş 1x 10 cm'lik bir tabağa aktarın.
- Sonra, embriyoları rahimden çıkarın. Rahmi dikkatlice kesin ve 2 forseps kullanarak embriyolara zarar vermeden amniyon çıkarın. Daha sonra, her embriyoyu bir makasla kesin ve kafaları hazırlama ortamı ile birlikte verilen 10 cm'lik ikinci bir tabağa aktarın.
- Kafaların hazırlanmasına devam edin (1.4 - 1.7'de açıklanan hazırlığa benzer).
- Başı bir çift forseps ile hareketsiz hale getirin ve boyun bölgesinde arka beyne yakın, nöraksiye dik olarak kafatasını ve cildi kesin. Hem kafatasını hem de cildi kaplamak için ikinci bir forseps çifti kullanın ve yumuşak kafatası kapağını başın rostral ucuna doğru bükün, böylece beyni açığa çıkarın.
- 2 forseps yardımıyla beyni kafatası boşluğundan ayırın. Bunu yapmak için, 1 çift forseps kapatın ve beyni, koku ampullerinden başlayarak ve arka beyne doğru hareket ederek kafatasından ayırın. Beyinleri, hazırlama ortamı ile doldurulmuş 10 cm'lik başka bir tabakta toplayın.
- Astrosit hazırlığı için hipokampusu yukarıda tarif edildiği gibi korteks parçalarından inceleyin (adım 1.6). Hipokampusları her yarım küreden çıkarın ve hazırlama ortamı ile doldurulmuş 2 mL'lik tüpte toplayın.
- Diseksiyonu tamamladıktan sonra, tüpü steril laminer akış tezgahına aktarın ve hipokampal dokuyu papain içeren 1 mL sindirim solüsyonu ile sindirin. Sindirim çözeltisini adım 1.9 - 1.10'da açıklandığı gibi hazırlayın, ancak bunun yerine MEM kullanın DMEM.
NOT: 3.9 - 3.12 arasındaki adımlar kritiktir ve 10 - 15 dakika içinde tamamlanmalıdır.
- Sindirimin tamamlanmasından sonra, bir pipetle hafifçe emerek sindirim solüsyonunu dikkatlice geri çekin.
- Hipokampusu 3 kez nöron ortamı ile sırayla ekleyerek ve daha sonra yıkama döngüsü başına 1 mL taze kültür ortamını dikkatlice aspire ederek yıkayın. Hücre süspansiyonunu santrifüjlemeyin.
- Son yıkama adımından sonra, dokuyu 1 mL nöron ortamında dikkatlice ezin.
- Hücreleri bir sayma odası kullanarak sayın ve 24 oyuklu bir plakanın tek bir oyuğu başına 500 μL nöron ortamında 35.000 hücre plakalayın (3.2'de belirtilen plaka).
NOT: İsteğe bağlı olarak, hücre preparatının canlılığını değerlendirmek için bir hücre alikotu tripan mavisi ile karşı boyanabilir. Mikroskop kullanarak görsel inceleme ile kaplama yoğunluğunu kontrol edin (tipik olarak standart bir 10X objektifin görme alanı başına 90 - 110 hücre).
- Nöronları 37 °C'de, 1 saat boyunca% 6 v / v CO2 inkübatöre yerleştirin.
- İnkübasyon sonrası, hazırlanan ekleri (birleşik astrosit tek tabakaları ile tohumlanmış) inkübatörden çıkarın (bkz. adım 2.8). Astrosit ortamını aspire ederek ve onu 500 μl taze nöron ortamı ile değiştirerek ortamı değiştirin.
NOT: Ekler, 2 - 3 DIV'den (Days In Vitro) sonra birleşik astrosit tek katmanlarını barındırmalıdır.
- Astrositli ekleri, steril forseps kullanarak nöron kültürlerini içeren oyuklara (adım 3.13) dikkatlice yerleştirin.
- Elde edilen dolaylı nöron-astrosit ko-kültürünü 37 °C, %6 v/h CO2.
sıcaklıkta inkübatöre geri yerleştirin
NOT: Bu koşullar altında, nöronlar tamamen tanımlanmış bir ortamda 4 haftaya kadar yetiştirilebilir. Orta düzeyde bir değişiklik gerekli değildir. Uzun süreli kültürler için, 24 oyuklu plakadan buharlaşmayı azaltmak için boş kuyuların steril su ile doldurulması önerilir.
