Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Sıçan veya Fare Beyni Diseksiyonu
>NOT: Hem fareler hem de sıçanlar kullanılabilir. P8'den daha eski hayvanlar da kullanılabilir (P12'ye kadar test ettik), ancak meninkslerin çıkarılması giderek daha zor hale gelecektir. Ayrıca, hücre verimi ve sağlığı azalacaktır, çünkü yaşlı hayvanlardan alınan beyin hücreleri, doku ayrışması sırasında kırılabilecek karmaşık süreçler ve bağlantılar oluşturacak ve bu da hücre ölümünün artmasına yol açacaktır. Kortikal preparatlar burada tarif edilmiştir, ancak diğer beyin bölgeleri de kullanılabilir.
- % 0.05 tripsin-EDTA'yı 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
- CO2 konsantrasyonunu yavaşça yükselterek ve beyinleri izole ederek hayvanları (E19 yavruları veya P0-P8 hayvanları için hamile sıçanlar) ötenazi yapın. Aşağıdaki adımlar steril bir teknik gerektirir.
- Embriyonik doku ile çalışıyorsanız, önce embriyoları uterustan çıkarın ve embriyonik keseleri açın, ardından hemen kafaları makasla kesin. Tüm kafalar kesildiğinde, bunları önceden soğutulmuş bir diseksiyon ortamına aktarın.
- Kafalar ortama batırıldıktan sonra, cildi ve kafatasını (her ikisi de genç hayvanlarda çok yumuşaktır) forseps ile açın ve beyinciği sıkıştırın. Beynin geri kalanını dikkatlice yukarı kaldırın ve kafatasından çıkarın.
not: İki ila dört E19 embriyosu, diseksiyon gününde tabak başına 500.000 hücrede kaplanmış en az sekiz adet 10 cm'lik kortikal astrosit tabağı için yeterli doku verir.
- Yeni doğmuş veya daha büyük yavrular için, kafaları makasla kesin ve cildi başın arkasından burun ucuna kadar düz bir çizgide medial olarak keserek beyinleri izole edin. Cildi bir kenara çekin ve kafatasını dikkatlice sola ve sağa kesin, ardından kafatası kemiğini yukarı kaldırın. Beyinciğini kesin ve beynin geri kalanını kafatasından yukarı ve dışarı doğru kaldırın.
not: İki ila üç P0-P8 yavrusu, diseksiyon gününde tabak başına 500.000 hücrede kaplanmış en az sekiz adet 10 cm'lik kortikal astrosit tabağı için yeterli doku verir.
- Korteksi alttaki orta beyin yapısından ayırın. Forsepsleri hemisferler arasındaki uzunlamasına çatlağın içine yerleştirin, ardından forsepsleri her bir yarım küreyi serbest bırakmak için bir yarım kürenin korteks ve orta beyin yapıları arasında (uzunlamasına çatlağa dik) hareket ettirin.
- Forsepsleri kullanarak, her yarım küreden (ve hipokampusundan) tüm meninksleri çıkarın, ardından hipokampusu ayırın. Hipokampal astrositler gerekiyorsa, her hipokampusu buz üzerinde 14 mL diseksiyon ortamı ile doldurulmuş 15 mL'lik bir tüpe taşıyın.
- Belirli bölgeler gerekiyorsa (örneğin, frontal korteks) her yarım kürenin korteksinden daha fazla alan çıkarın. Astrosit oluşturmak için kullanılacak herhangi bir kortikal dokuyu 1 mm3'ten büyük olmayan parçalar halinde kesin. Tüm kortikal doku parçalarını, buz üzerinde bir diseksiyon ortamı ile doldurulmuş 15 mL'lik ayrı bir tüpte toplayın.
2. Doku Sindirimi ve Ayrışması
- Tüm doku parçaları toplandıktan sonra, tüpün dibine çökmelerini bekleyin, ardından mümkün olduğunca fazla besiyerini aspire edin.
- Serolojik bir pipet kullanarak 2-3 mL% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin ve tüpleri 37 ° C'lik bir su banyosunda 20 dakika < br / > inkübe edin
not: Doku parçalarını karıştırmak ve tekrar yerleşmelerini sağlamak için tüm tripsin-EDTA'yı pipetten hızla boşaltın.
- Tripsin-EDTA'yı dikkatlice aspire edin, doku parçalarını tüpün dibinde mümkün olduğunca az sıvı içinde bırakın.
- Kalan tripsin-EDTA'yı yıkamak için 5 mL önceden soğutulmuş diseksiyon ortamı ekleyin. Doku parçalarının karıştırılmasını sağlamak için tüpün üst kısmının yan tarafına pipetleyin.
- Diseksiyon ortamını aspire edin ve doku parçalarını mümkün olduğunca az sıvı içinde bırakın. Bu yıkama adımını önceden soğutulmuş diseksiyon ortamı ile iki kez daha tekrarlayın.
- Son yıkama adımından sonra, 1.000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak 1 mL DMEM+ (oda sıcaklığına ısıtılmış) ekleyin ve kabarcıklar oluşturmadan yukarı ve aşağı pipetleyerek dokuyu ezin.
not: Kabarcık üretmekten kaçınmak önemlidir, çünkü bu, astrositlerin oldukça hassas olduğu çözeltinin pH'ını değiştirebilir.
- 50 mL'lik bir tüpün ağzına 100 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin ve filtreyi 4,5 mL önceden soğutulmuş DMEM+ ile önceden ıslatın.
- 1 mL ayrışmış doku süspansiyonunu hücre süzgecine pipetleyin ve hücreleri hücre süzgecinden yıkamak için 4,5 mL önceden soğutulmuş DMEM+ daha ekleyin.
3. Geçiş Hücreleri
- Geçişten bir gün önce, hücre kültürü plakalarını% 0.04 PEI ile kaplayın.
- Diseksiyondan sonraki gün in vitro (DIV) 7'de, DMEM + içindeki hücrelerle 10 cm'lik tabakları inkübatördeki bir laboratuvar çalkalayıcıya yerleştirin ve bulaşıkları 6 saat boyunca 110 rpm'de çalkalayın.
- PEI'yi kaplanmış lamellerden iki kez deiyonize edilmiş, damıtılmış su ile yıkayın. Plakalara NB + H ortamı ekleyin (24 oyuklu plakalar için oyuk başına 500 μL ve 6 oyuklu plakalar için oyuk başına 2 mL). 10 cm'lik tabaklar çalkalanırken veya en az 30 dakika boyunca inkübatördeki plakaları 37 °C ve% 5 CO2'de önceden dengeleyin.
- 6 saatlik çalkalamanın bitiminden 20-30 dakika önce, su banyosunda 1x PBS, DMEM +, NB + H ve% 0.25 tripsin-EDTA'yı 37 ° C'ye ısıtın.
- 6 saat çalkaladıktan sonra, kültür kaplarını çalkalayıcıdan çıkarın ve hemen ortamı (çalkalanmış nöronlar, oligodendrositler ve mikroglia içeren) tabak başına 10 mL önceden ısıtılmış 1x PBS ile değiştirin.
not: Astrositik olmayan hücrelerin yeniden bağlanmasını önlemek için ayrılmış hücreler içeren eski ortamı hemen aspire etmek önemlidir.
- PBS'yi çıkarın ve tabak başına 3 mL önceden ısıtılmış tripsin-EDTA ekleyin. Her bir yemeği inkübatörde 37 °C ve% 5 CO2'de 4 dakika inkübe edin
- Her tabaktaki 3 mL tripsin-EDTA'ya 5 mL önceden ısıtılmış DMEM+ ekleyin, hücreleri 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak tabaktan pipetleyin ve hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir tüpte toplayın.
not: Doğrudan tabağın altından pipetleyin - hücreler ayrıldıkça tabağın tabanı daha net hale gelmelidir. Serum tripsini inaktive ettiği için sadece serum içeren ortam (DMEM + yerine) kullanın.
- Hücre süspansiyonunu 3,220 x g'da 20 ° C'de 4 dakika santrifüjleyin.
- Süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 1 mL önceden ısıtılmış NB+H'de yeniden süspanse edin.
4. Son Astrosit Kültürleri için Hücre Kaplaması
- Hücreleri sayın.
- 6 oyuklu plakalarda (oyuk başına 2 mL NB + H ortamında) kuyucuk başına 20.000 hücre veya 24 oyuklu plakalarda (oyuk başına 500 μL NB + H ortamda) kuyu başına 5.000 hücre plakalayın.
- Hücre kültürlerini daha fazla tedavi veya analize kadar inkübatörde 37 ° C'de ve% 5 CO2'de tutun.
