$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. rtTA/Ngn2-pozitif hiPSC'lerin 6 oyuklu MEA'lar ve Cam Lameller Üzerindeki Nöronlara Farklılaşması
>NOT: Bu protokolde, rtTA/Ngn2-pozitif hiPSC'lerin iki farklı substrat üzerinde ayırt edilmesi için ayrıntılar sağlanmıştır, yani 6 oyuklu MEA'lar (kuyu başına 9 kayıt ve 1 referans gömülü mikroelektrotlu 6 bağımsız kuyudan oluşan cihazlar) ve 24 oyuklu bir plakanın kuyucuklarındaki cam lameller. Bununla birlikte, protokoller, belirtilen değerleri yüzey alanına göre ölçeklendirerek daha büyük substratlar için (örneğin, 12 veya 6 oyuklu plakaların kuyuları için) kolayca uyarlanabilir.
- MEA'ları veya cam lameller hazırlayın (0. gün ve 1. gün)
- Farklılaşmanın başlamasından bir gün önce, MEA'ları üreticinin tavsiyesine göre sterilize edin.
- Yapışma proteini Poli-L-Ornitin'i (PLO) steril ultra saf suda 50 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Her bir oyuğa 100 μL'lik bir damla seyreltilmiş FKÖ yerleştirerek 6 oyuklu MEA'ların aktif elektrot alanını kaplayın. Lamelleri steril cımbız kullanarak 24 oyuklu plakanın kuyularına yerleştirin. Her oyuğa 800 μL seyreltilmiş PLO ekleyin. 1000 μL pipet ucu ile lamelleri aşağı doğru iterek yüzmesini önleyin.
- 6 oyuklu MEA'ları ve 24 oyuklu plaka O/N'yi nemlendirilmiş 37 °C'lik bir inkübatörde %5 CO2 atmosferi ile inkübe edin. Ertesi gün, seyreltilmiş FKÖ'yü aspire edin. 6 kuyulu MEA'ların cam yüzeylerini ve lamelleri steril ultra saf su ile iki kez yıkayın.
- Laminini soğuk DMEM / F12'de 20 μg / mL (6 oyuklu MEA'lar için) ve 10 μg / mL (cam lameller için) nihai konsantrasyona seyreltin. Her bir oyuğa 100 μL'lik bir damla koyarak 6 oyuklu MEA'ların aktif elektrot alanını hemen kaplayın. Benzer şekilde, lamelleri kaplamak için 24 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 400 μL seyreltilmiş laminin ekleyin. 1.000 μL pipet ucu ile aşağı doğru iterek lamellerin yüzmesini önleyin.
- 6 oyuklu MEA'ları ve 24 oyuklu plakayı, en az 2 saat boyunca% 5 CO2 atmosferi ile nemlendirilmiş 37 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin.
- HiPSC'leri plaka (1. gün)
NOT: Adım 3.2.1 - 3.2.4'te bahsedilen hacimler, rtTA/Ngn2 pozitif hiPSC'lerin 6 oyuklu bir plakada kültürlendiğini ve bir oyuklu hücrelerin hasat edildiğini varsayar. Hücrelerin 6 oyuklu MEA'lar ve/veya lameller üzerine kaplanması için gereken hacimler, 6 oyuklu MEA'ların sayısına ve/veya deneyde kullanılan lamellerin sayısına bağlıdır; Adım 3.2.6 - 3.2.8'de belirtilen sayılar, farklı deney boyutlarına ölçeklendirmeye izin verir.
- % 1 (v / h) penisilin / streptomisin ile R / T'ye sıcak DMEM / F12, CDS ve E8 ortamı. 4 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona doksisiklin ve E8 ortamına ROCK inhibitörü ekleyin.
- rtTA/Ngn2 pozitif hiPSC'lerin harcanan ortamını aspire edin ve hiPSC'lere 1 mL CDS ekleyin. % 5 CO2 atmosferine sahip nemlendirilmiş 37 ° C'lik bir inkübatörde 3 - 5 dakika inkübe edin. Mikroskop altında hücrelerin birbirinden ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin.
- Kuyucuğa 2 mL DMEM / F12 ekleyin, hücreleri 1.000 μL'lik bir pipetle nazikçe askıya alın ve hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın. Hücre süspansiyonuna 7 mL DMEM / F12 ekleyin. Hücreleri 5 dakika boyunca 200 x g'da döndürün.
- Süpernatanı aspire edin ve hazırlanan E8 ortamından 2 mL ekleyin. 1.000 μL'lik bir pipetin ucunu 15 mL'lik tüpün kenarına koyarak ve hücreleri nazikçe yeniden süspanse ederek hiPSC'leri ayırın. Mikroskop altında hücrelerin ayrışıp ayrışmadığını kontrol edin.
- Bir hemositometre odası kullanarak hücre sayısını (hücre / mL) belirleyin.
not: % 80 - 90 birleşmede 6 oyuklu bir plaka kuyusu tipik olarak toplamda 3.0 - 4.0 x 106 hücre verecektir.
- Seyreltilmiş laminini aspire edin. 6 oyuklu MEA'lar için, 7.5 x 105 hücre / mL'lik bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri seyreltin. 6 oyuklu MEA'ların her bir oyuğundaki aktif elektrot alanına 100 μL'lik bir damla hücre süspansiyonu ekleyerek hücreleri plakalayın. Lameller için, 4.0 x 104 hücre / mL'lik bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücreleri seyreltin. 24 oyuklu plakanın kuyucuklarına 500 μL hücre süspansiyonu ekleyerek hücreleri plakalayın.
not: MEA'lar üzerindeki nihai hücre yoğunluğu, lamellerden daha yüksektir (Şekil 1A ve B). Bu yüksek hücre yoğunluğunun, ağ aktivitesini düzgün bir şekilde kaydetmek için gerekli olduğunu bulduk. Protokolde, tahliller için en uygun olan sayılar verilmiştir.
- 6 oyuklu MEA'ları ve 24 oyuklu plakayı, 2 saat (MEA'lar) veya O/N (24 oyuklu plaka) boyunca% 5 CO2 atmosferine sahip nemlendirilmiş 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
- 2 saat sonra, 6 oyuklu MEA'ların her bir oyuğuna dikkatlice 500 μL hazırlanmış E8 ortamı ekleyin. 6 oyuklu MEA's O/N'yi %5 CO2 atmosferine sahip nemlendirilmiş 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
- Ortamı değiştirin (2. gün)
- Ertesi gün %1 (h/h) N-2 takviyesi, %1 (h/h) esansiyel olmayan amino asitler ve %1 (h/h) penisilin/streptomisin ile DMEM/F12 hazırlayın. İnsan rekombinant nörotrofin-3'ü (NT-3) 10 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyona, insan rekombinant beyin kaynaklı nörotrofik faktörü (BDNF) 10 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyona ve doksisiklini 4 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Ortamı 37 °C'ye ısıtın.
- Ortama 0.2 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona laminin ekleyin. Elde edilen ortamı filtreleyin. Harcanan ortamı 6 oyuklu MEA'ların kuyularından ve 24 oyuklu plakadan aspire edin ve hazırlanan ortamla değiştirin. 6 oyuklu MEA'ları ve 24 oyuklu plaka O/N'yi nemlendirilmiş 37 °C'lik bir inkübatörde %5 CO2 atmosferi ile inkübe edin.
- Sıçan astrositleri ekleyin (3. gün)
NOT: Bu protokolde bahsedilen hacimler, sıçan astrositlerinin T75 kültür şişelerinde kültürlendiğini varsayar. Kültürlere eklenen sıçan astrositlerinin iyi kalitede olması çok önemlidir. Sıçan astrositlerinin iyi kalitede olup olmadığını kontrol etmek için iki kriter kullanıyoruz. İlk olarak, sıçan astrosit kültürü, sıçan embriyonik beyinlerinden izole edildikten sonraki on gün içinde birleşerek büyüyebilmelidir. İkincisi, sıçan astrosit kültürünü böldükten sonra, sıçan astrositleri birleşik, mozaikli bir tek tabaka oluşturabilmelidir (Şekil 1C). Sıçan astrosit kültürü bu iki kriteri karşılamıyorsa, bu kültürü farklılaşma deneyleri için kullanmamanızı tavsiye ederiz.
- % 0.05 tripsin-EDTA'yı RT'ye ısıtın. DPBS ve DMEM / F12'yi %1 (h / h) penisilin / streptomisin ile 37 ° C'ye ısıtın.
- Sıçan astrosit kültürünün harcanan ortamını aspire edin. Kültürü 5 mL DPBS ekleyerek yıkayın ve hafifçe çevirin.
- DPBS'yi aspire edin ve 5 mL% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. Tripsin-EDTA'yı hafifçe çevirin. %5CO2 atmosferine sahip nemlendirilmiş 37 °C'lik bir inkübatörde 5-10 dakika inkübe edin.
- Mikroskop altında hücrelerin ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin. Şişeye birkaç kez vurarak son hücreleri ayırın.
- Şişeye 5 mL DMEM / F12 ekleyin. Hücreleri 10 mL'lik bir pipetle şişenin içinde nazikçe ezin. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir tüpte toplayın. Tüpü 8 dakika boyunca 200 x g'da döndürün.
- Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 1 mL DMEM / F12'de yeniden süspanse edin. Bir hemositometre odası kullanarak hücre sayısını (hücre / mL) belirleyin.
- 6 oyuklu MEA'ların oyuğu başına 7,5 x 104 astrosit ekleyin. 24 oyuklu plakanın oyuğu başına 2.0 x10 4 astrosit ekleyin. MEA'ları ve 24 oyuklu plaka O/N'yi %5 CO2 atmosferine sahip nemlendirilmiş 37 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin.
- Ortamı değiştirin (4. gün)
- %2 (h/h) B-27 takviyesi, %1 (h/h) L-alanil-L-glutamin ve %1 (h/h) penisilin/streptomisin içeren nörobazal ortam hazırlayın. NT-3'ü 10 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyona, BDNF'yi 10 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyona ve doksisiklini 4 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. Ek olarak, 2 μM.
'lik bir konsantrasyona sitozin β-D-arabinofuranosid ekleyin
NOT: Astrosit proliferasyonunu inhibe etmek ve nöronlara farklılaşmayan kalan hiPSC'leri öldürmek için ortama sitozin β-D-arabinofuranosid eklenir.
- Ortamı filtreleyin ve 37 ° C'ye ısıtın. Harcanan ortamı 6 oyuklu MEA'ların kuyularından ve 24 oyuklu plakadan aspire edin ve hazırlanan ortamla değiştirin. 6 oyuklu MEA'ları ve 24 oyuklu plakayı,% 5 CO2 atmosferine sahip nemlendirilmiş 37 ° C'lik bir inkübatörde tutun.
- Ortamı yenileyin (gün 6 - 28)
NOT: 6. günden başlayarak, ortamın yarısını iki günde bir yenileyin. 10. günden itibaren, astrosit canlılığını desteklemek için besiyeri FBS ile desteklenir.
- %2 (h/h) B-27 takviyesi, %1 (h/h) L-alanil-L-glutamin ve %1 (h/h) penisilin/streptomisin içeren nörobazal ortam hazırlayın. NT-3'ü 10 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyona, BDNF'yi 10 ng / mL'lik bir nihai konsantrasyona ve doksisiklini 4 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin. 10. günden itibaren, ortamı da %2,5 (h/h) FBS ile destekleyin. Elde edilen ortamı filtreleyin ve 37 °C'ye ısıtın.
- Harcanan ortamın yarısını 1000 μL'lik bir pipet kullanarak 6 oyuklu MEA'ların kuyularından ve 24 oyuklu plakadan çıkarın ve hazırlanan ortamla değiştirin. 6 oyuklu MEA'ları ve 24 oyuklu plakayı,% 5 CO2 atmosferine sahip nemlendirilmiş 37 ° C'lik bir inkübatörde tutun.
