$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Asılı damla kültürü olarak nöron toplarının hazırlanması (Days in vitro (DIV) 0-3)
NOT: Nöron topu kültürünün hazırlanması için burada açıklanan prosedürler, Sasaki grubu tarafından bazı modifikasyonlarla daha önce bildirilen yönteme dayanmaktadır. Ayrıca, ayrışmış kültür için Banker yönteminden çeşitli prosedürler benimsedik.
- Diseksiyona başlamadan önce aşağıdakilerin onaylanması
- Gerekli tüm solüsyonları hazırlayın ve önceden otoklav/filtrasyon ile sterilize edin.
- Bu kortikal nöron kültürünün her adımında kullanılacak tüm aletleri ve malzemeleri hazır bulundurun.
- Laminer hava akış kabinini, diseksiyon masasını, stereomikroskop sahne plakasını, makası ve forsepsleri %70 etanol ile püskürtün ve silin.
- CO2 uygulaması üzerine fareyi ötenazi yapın ve E16 embriyoları elde etmek için karnı inceleyin.
- Beyinleri forsepsin ince uçları yardımıyla embriyolardan dikkatlice çıkarın ve 4 mL 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit, HEPES Tamponlu Tuz Çözeltisi (HBSS) içeren 60 mm'lik hücre kültürü kaplarına aktarın.
not: Diseksiyon ortamı HBSS, 10 mM HEPES (pH 7.4), 140 mM sodyum klorür (NaCl), 5.4 mM potasyum klorür (KCl), 1.09 mM di-sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4), 1.1 mM potasyum dihidrojen fosfat (KH2PO4), 5.6 mM D-glikoz ve 5.64 μM fenol kırmızısı içerir.
- Kafa derisini çıkarın, koku soğancığını kesin, stereomikroskop altında forsepsin ince uçlarını kullanarak her serebral hemisferden korteksleri ayırın ve taze HBSS içeren 60 mm'lik başka bir tabaklara aktarın. Her ayrı nöron topu kültürü için en az 3-5 embriyo kullanın.
- Laminer akışlı hücre kültürü başlığında mikrodiseksiyon yaylı makasla korteksleri küçük parçalar halinde kesin.
- Kıyılmış korteksleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve kıyılmış korteksleri 37 ° C'de bir su banyosunda 4.5 dakika boyunca HBSS'de 4 mL% 0.125 tripsin içinde tripsinize edin< br / >
not: Bu tripsinizasyon süresi, verimli nöron kültürü için kritik öneme sahiptir, çünkü artan süre (> 4,5 dakika) çok daha fazla ölü nörona yol açar.
- Hücre agregalarını steril bir transfer pipeti ile 10 mL HBSS içeren 15 mL'lik yeni bir tüpe aktarın ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
- Hücre agregalarını GlutaMax, B27 takviyesi (NGB ortamı),% 0.01 DNaz I ve% 10 at serumu içeren 2 mL Nörobazal ortam içeren 15 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.
- Tripsinizli korteksleri, ateşle parlatılmış ince bir cam Pasteur pipeti kullanarak tekrar tekrar yukarı ve aşağı (3-5 kez) pipetleyerek ezin.
not: Ateşle parlatılmış ince cam Pasteur pipetinin çapı, Banker yöntem belgesinde açıklandığı gibi çok önemlidir. Pipet korteksleri geçemeyecek kadar darsa, 2-3 farklı boyutta pipetler hazırlayın ve daha büyük bir pipetten deneyin.
- Nöron toplarını hazırlamak için, yukarıdaki hücre süspansiyonunu alın ve bir NGB ortamı kullanarak hücre yoğunluğunu 1 x 106 hücre / mL'ye ayarlayın.
- Kortikal nöronları, 10 cm'lik kültür kaplarının üst kapaklarının içinde 10.000 hücre/damla (1 damla 10 μL'dir) içeren asılı damlalar olarak kültürleyin.
- Kültür kaplarının alt kısmına 7 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin, daha sonra nöron topu oluşumuna izin vermek için nemlendirilmiş koşullar altında% 5 CO2 ile 37 ° C'de 3 gün boyunca bir inkübatörde tutun.