$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Ayrışmış Erişkin dorsal kök ganglion Nöronu veya DRG Nöronunun Kültür Hazırlığı
- Kültürü kurmadan önce, poli-D-lizin ve laminin ile 6 oyuklu bir plakayı önceden kaplayın. % 0.01 poli-D-lizin içeren 6 oyuklu bir plakayı 37 ° C'de 2 saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Ardından, plakayı iki kez damıtılmış suyla yıkayın.
- Plakayı oda sıcaklığında 2 saat boyunca 3 μg / mL konsantrasyonda laminin çözeltisi ile inkübe edin ve ardından plakayı iki kez damıtılmış su ile yıkayın. Plakayı oda sıcaklığında en az 1 saat kurutun.
- Sıkıştırılmış bir CO2 gaz silindirine bağlı şeffaf bir CO2 odasında bir fareyi ötenazi yapın. Omurganın üzerindeki cildi cerrahi bir bıçakla kesin ve omurga kemiklerini ortaya çıkarmak için paravertebral kasları iki taraflı olarak inceleyin. DRG'ler tamamen açığa çıkana kadar dar uçlu bir cerrahi rongeur kullanarak omur kemiklerini titizlikle çıkarın.
not: Yetişkin DRG nöronları, 8 hafta ile 12 haftalık yaşları arasındaki yetişkin C57BL6 erkek farelerden elde edilir.
- DRG'leri iridektomi makası ve diseksiyon mikroskobu altında ince uçlu forseps kullanarak S1'den C1 seviyesine kadar bilateral olarak çıkarın. Schwann hücrelerinin veya fibroblastların kontaminasyonunu en aza indirmek için kökleri DRG'lerden tamamen kesmeye çalışın.
- Disseke edilmiş DRG'leri, 5 mL soğuk Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) içeren 60 mm'lik bir Petri kabında, kalan DRG'ler toplansa bile, tüm DRG'ler bir sonraki adım olana kadar buz üzerinde saklayın.
not: DRG'leri mümkün olduğunca çabuk incelemek çok önemlidir. Tüm DRG'lerin bir fareden toplanması 30 dakikadan uzun sürmemelidir. Ötenaziden sonra 30 dakika, DRG'leri toplamayı bırakın ve DRG'leri mavi bir pipet ucu (1000 μL) kullanarak 1,5 mL'lik bir Eppendorf tüpüne aktarın. Mini bir santrifüj kullanarak birkaç saniye hızlı bir dönüşten sonra DMEM'i çıkarın. 125 U / mL tip XI kollajenaz içeren 1 mL DMEM ekleyin ve tüpü 37 ° C'lik bir inkübatörde bir twister çalkalayıcı kullanarak hafif bir dönüşle (35-40 rpm) 90 dakika inkübe edin. Bandı kullanarak tüpü çalkalayıcı zemininde hareketsiz hale getirin.
- Kollajenaz içeren DMEM'i atın ve 1 mL taze DMEM ekleyin. Yüzen DRG'ler tamamen dibe çökene kadar bekleyin ve ardından doku kalıntılarıyla birlikte DMEM'i çıkarın. Bu yıkama adımını en az altı kez tekrarlayın.
not: Süpernatanı tamamen atmaya çalışmayın. Süpernatan DMEM ile herhangi bir DRG'yi çıkarmamaya dikkat edin.
- DRG'leri, kesme ucu olan mavi bir pipet ucu (15 μL) kullanarak 1000 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Daha sonra homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için mavi bir uç (1000 μL) kullanarak en az 15 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Kabarcık yapmaktan kaçının ve konik borunun altına pipet ucuyla dokunmamaya çalışın.
- Tüpü 239 x g'da 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı yüzen kalıntılarla dikkatlice atın. B27 (%2.0 v/v) ile takviye edilmiş 1 mL Nörobazal ortam ekleyin ve 5 ila 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini yeniden süspanse edin.
- Hücre süspansiyonunu, 50 mL'lik bir konik tüpün üzerine yerleştirilmiş 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin. 2 dakika bekleyin ve ardından Neurobazal/B-27 ortamını bir pipet kontrolörü kullanarak süzgecin üzerine dökün.
- Toplanan tüm DRG nöronlarını (bir fareden yaklaşık 2 x 106 DRG nöronu) 6 oyuklu plakanın iki kuyusuna plakalayın. Bir yetişkin fareden alınan DRG nöronları, 6 oyuklu bir plakada iki kuyuyu kaplar. Daha sonra plakayı, makrofaj ko-kültürleri oluşana kadar 37 ° C'de bir CO2 inkübatörüne yerleştirin.
2. Bir Hücre Kültürü Ekinde Primer Peritoneal Makrofajların Ko-kültürü
NOT: Ayrışmış DRG nöronlarının ilk kaplamasından 4 saat sonra ko-kültürleri oluşturun
- Primer peritoneal makrofajlar, 8 hafta ila 12 haftalık yaşları arasındaki yetişkin C57BL6 erkek farelerden hazırlanır. Bir CO2 odasında bir hayvana ötenazi yapın. Karın derisini hassas bir şekilde kesin, peritonu açığa çıkarın ve lavaj sıvısının sızmasını önlemek için peritonu kesmekten kaçının.
- 22G iğneli bir şırınga kullanarak peritonu delin ve periton boşluğuna 10 mL buz gibi soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) enjekte edin. Peritona 1-2 dakika boyunca hafifçe masaj yapın. Daha sonra iğneyi dışarı çekin ve PBS'yi iğne delme bölgesinden sıkın ve lavaj sıvısını 50 mL'lik konik bir tüpte toplayın.
not: Kullanmadan önce, PBS'nin soğukluğunu korumak için şırıngayı buzun üzerine koyun.
- Hücresel bileşenleri peletlemek için lavaj sıvısını 239 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Peletleri 3 mL kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponu ile oda sıcaklığında 3 dakika boyunca yeniden süspanse edin. Daha sonra hücre süspansiyonunu 4 ° C'de 10 dakika boyunca 239 x g'da tekrar santrifüjleyin. Peleti 3 mL PBS ile yeniden süspanse edin ve kalan RBC lizis tamponunu çıkarmak için hücre süspansiyonunu tekrar santrifüjleyin.
not: RBC lizis tamponunun tamamen çıkarıldığından emin olun. Aksi takdirde, kalan RBC lizis tamponu kültürlenmiş makrofajlar için toksik olabilir.
- Peletlenmiş hücreleri 1 mL Nörobazal / B-27 ortamında yeniden süspanse edin. Toplanan tüm makrofajların yarısını (toplam 3 × 106 ila 6 x 106 hücre), ayrışmış DRG.
kuyusunun üzerine yerleştirilen 4.2cm2'lik bir hücre kültürü eki üzerine yerleştirin.
not: Ko-kültür döneminde, makrofajlar Nörobazal / B-27 nöron kültür ortamında büyütülür. Bu koşul altında makrofajların yeterli sağkalımı doğrulandı.
3. db-cAMP (dibutiril-siklik AMP) tedavisi ve Makrofaj CM'nin toplanması
NOT: Nöron-makrofaj ko-kültürlerinden 4 saat sonra db-cAMP tedavisine başlayın.
- Nöron-makrofaj ko-kültürlerine 2 μL 100 μM db-cAMP çözeltisi ekleyin. Bir denetim denemesi için aynı hacimde PBS ekleyin.
- 24 saat sonra, aynı 6 oyuklu plakada boş bir kuyuyu 1 mL makrofaj kültür ortamı ile doldurun. Nöron-makrofaj ko-kültürlerindeki hücre kültürü ekini bir makrofaj kültür ortamı ile boş kuyuya aktarın. Ortamı değiştirmeden hücreleri 72 saat boyunca aynı durumda tutun.
not: Konsantre CM yapmak için CM toplama sırasında sadece 1 mL makrofaj kültür ortamı ekliyoruz. CM toplama sırasında, gerekirse, ek içindeki makrofajları tamamen kaplamak için daha fazlasını ekledik.
- 72 saat sonra, hücresel bileşenleri çıkarmak için makrofaj CM'yi 239 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Kalan hücresel kalıntıları temizlemek için süpernatanı 0,2 μm'lik bir filtreden geçirin. Toplanan CM'yi kullanana kadar -70 °C'de saklayın.