Nöron uzantılarını teşvik etmek için makrofaj şartlandırılmış bir ortam kullanma

Özet

Kaynak: Yun, H. J., et al. Nörit Büyüme Aktivitesi ile Moleküler Faktörler Salgılayan Makrofajları Aktive Etmek için Nöron-Makrofaj Ko-kültürleri. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, makrofaj koşullu ortamı kullanarak nörit büyümesi olarak bilinen nöron projeksiyonlarının büyümesini teşvik etmek için bir testi göstermektedir. Nöronları ve makrofajları cAMP ile birlikte kültürleyin ve makrofajdan türetilmiş şartlandırılmış ortamı hasat edin. Nöronların şartlandırılmış ortamla büyütülmesi, nörit büyümelerini teşvik eder. Bu çıkıntılar floresan olarak etiketlenir ve bir floresan mikroskobu kullanılarak görselleştirilir.

Protokol

1. Db-Camp'ın Tedavisi ve Makrofaj Şartlandırılmış Besiyerinin Toplanması

>NOT: Nöron-makrofaj ko-kültürlerinden 4 saat sonra db-cAMP tedavisine başlayın.

1. Nöron-makrofaj ko-kültürlerine 2 μL 100 μM dibutiril siklik AMP (db-cAMP) çözeltisi ekleyin. Bir kontrol deneyi için aynı hacimde fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.
2. 24 saat sonra, aynı 6 oyuklu plakada boş bir kuyuyu 1 mL makrofaj kültür ortamı ile doldurun. Nöron-makrofaj ko-kültürlerindeki hücre kültürü ekini makrofaj kültür ortamı ile boş kuyuya aktarın. Ortamı değiştirmeden hücreleri 72 saat boyunca aynı durumda tutun.
   not: Konsantre CM yapmak için şartlandırılmış ortam (CM) toplama sırasında sadece 1 mL makrofaj kültür ortamı ekliyoruz. CM toplama sırasında, gerekirse, ek içindeki makrofajları tamamen kaplamak için daha fazlasını ekledik.
3. 72 saat sonra, hücresel bileşenleri çıkarmak için makrofaj CM'yi 239 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Kalan hücresel kalıntıları temizlemek için süpernatanı 0,2 μm'lik bir filtreden geçirin. Toplanan CM'yi kullanana kadar -70 °C'de saklayın.

2. Toplanan CM ile Nörit Büyüme Testi

1. Ayrı bir yetişkin DRG nöron kültürü kurmadan önce, poli-D-lizin ve laminin ile 8 oyuklu bir odacıklı slaytı önceden kaplayın. % 0.01 poli-D-lizin içeren 6 oyuklu bir plakayı 37 ° C'de 2 saat veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Ardından, plakayı iki kez damıtılmış suyla yıkayın.
2. Plakayı oda sıcaklığında 2 saat boyunca 3 μg / mL konsantrasyonda laminin çözeltisi ile inkübe edin ve ardından plakayı iki kez damıtılmış su ile yıkayın. Plakayı oda sıcaklığında en az 1 saat kurutun.
3. B27 ile takviye edilmiş Nörobazal ortamda ayrışmış yetişkin DRG nöronları elde edin. Plaka 5 x 10^{Kuyu başına 4} hücre, önceden kaplanmış 8 oyuklu hazne kızağı üzerine.
4. Hazne sürgüsünü 2 saat boyunca 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin dibe yapışmasına izin verin. Ardından, kültür ortamını 37 ° C'de önceden ısıtılmış çözülmüş CM ile değiştirin
   not: Kültür ortamını çıkarırken ve toplanan CM'yi eklerken 8 oyuklu hazne slaytının dibine dokunmamaya dikkat edin.
5. İlk kaplamadan 15 saat sonra, ortamı çıkarın ve hücreleri PBS ile bir kez yıkayın. Daha sonra, kuyucuklara 200 μL buz gibi% 4 paraformaldehit çözeltisi ekleyin ve hücreleri paraformaldehit çözeltisi ile 4 ° C
   'de 20 dakika inkübe edin not: Nörit büyüme testi için DRG nöron kültürü tam olarak 15 saat ile sınırlandırılmalıdır. Bu koşul altında, kayda değer bir nörit büyümesi yoktur.
6. Buz gibi soğuk PBS ile üç kez yıkayın ve ardından 30 dakika boyunca% 0.1 Triton-X ile% 10 normal keçi serumu (NGS) ile blokaj yapın. Sabit hücreleri% 10 NGS (1 μg / mL konsantrasyonda) ile seyreltilmiş birincil antikor (anti-Tuj-1) çözeltisi ile 4 saat boyunca oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
7. PBS ile üç kez yıkayın ve daha sonra hücreleri oda sıcaklığında 2 saat boyunca ikincil antikor (keçi-anti fare) çözeltisi ile inkübe edin. Daha sonra, PBS ile iki kez yıkayın ve bir montaj solüsyonu kullanarak kültür slaytını bir lamel (24 × 50 mm) ile monte edin.
8. Nörit büyümesini görselleştirmek için bir floresan mikroskobu kullanarak görüntüler çekin (Şekil 1).

Sonuçlar

Şekil 1: Çeşitli koşullardan elde edilen şartlandırılmış ortam kullanılarak nörit büyümesi testinin temsili sonuçları. (A, B) Yetişkin DRG nöronları akut olarak ayrıştı ve tam olarak 15 saat boyunca kültürlendi. Kaplamadan 2 saat sonra, kültür ortamı, PBS (A) veya dibutiril cAMP (db-cAMP) (B) ile muamele edilen nöron-makrofaj ko-kültürlerinden elde edilen şartlandırılmış ortam (CM) ile değiştirildi. S...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Hücre kültürü eki şeffaf PET membran 0.4μm gözenek boyutu	Corning, Şahin	353090	6 oyuklu plaka için 0,4 μm gözenek boyutuna sahip şeffaf PET membran
70 μm naylon hücre süzgeci	Corning, Şahin	352350
8 oyuklu kültür slaytı	Biyokot	354632	tek tip bir Poli-D-Lizin uygulaması ile
Nörobazal ortam	Thermo Fisher Bilimsel, Gibco	21103-049	%1 glutamax ve %1 penicilin-streptomisin içerir
B-27 takviyesi, serumsuz	Thermo Fisher Bilimsel, Gibco	17504-044	Hücre dışı çözelti
Glutamax (Glutamaks)	Thermo Fisher Bilimsel, Gibco	35050-061
Penisilin-streptomisin	Thermo Fisher Bilimsel, Gibco	15140-122
Poli-D-lizin Hidrobromür	Sigma-Aldrich	P6407-5MG
Laminin	Thermo Fisher Bilimsel, Invitrogen	23017-015
Adenozin 3', 5'-siklik monofosfat, N6,O2'-dibutiril-, sodyum tuzu	Merck Millipore Şirketi, Calbiochem	28745
%10 Normal Keçi Serumu	Thermo Fisher Bilimsel	16210072
Triton-X-100	Daejung Kimya ve Metal A.Ş.	8566-4405
Anti β III tübülin (Tuj-1)	Promega Şirketi	G7121	Fare monoklonal antikoru
Keçi anti-Fare IgG (H + L) ikincil antikoru	Thermo Fisher Bilimsel, Invitrogen	A11005
Hematidometre	Marienfeld-Superior	Yok
Hücre kültürü CO2 inkübatörü	Panasonic Belediyesi	Yok
Masa üstü santrifüj	Sorvall Belediyesi	Yok
Konfokal mikroskop	Olimpos Amerika A.Ş	IX71
FBS (Fetal Sığır Serumu)	VWR Uluslararası, Hyclone	SH30919.03