Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Mikroakışkan oda veya MFC hazırlığı
- Birincil kalıplarda PDMS dökümü (Şekil 1)
- Ayrıntılı bir protokolü izleyerek birincil kalıplar (gofretler) satın alın veya oluşturun.
- Kaplama adımına geçmeden önce gofret platformundaki her türlü kiri temizlemek için basınçlı hava kullanın. Gofretlerin yüzeyi pürüzsüz ve berrak görünmelidir.
- Bir kabı 50 mL sıvı nitrojen ile doldurun. 10 mL'lik bir şırınga ve 23 G'lik bir iğne hazırlayın.
not: Bu adımdan itibaren tüm prosedürler kimyasal bir başlıkta gerçekleştirilmelidir.
- Kimyasal davlumbazda, 2 mL sıvı nitrojeni toplamak için şırınga ve iğneyi kullanın. Hava çekilmiş gibi görünse de, şırınga nitrojen ile doldurulur (Şekil 1A). Gofret içeren plakayı sızdırmaz bir kaba yerleştirin.
- Bir klorotrimetilsilan şişesini vidayla açın, nitrojen dolu şırıngayı kullanarak lastik kapağı delin ve şırınganın tüm içeriğini şişeye enjekte edin. İğneyi dışarı çekmeden şişeyi ters çevirin ve 2 mL klorotrimetilsilan.
geri çekin
not: Şırınga basıncı nedeniyle, iğneden az miktarda klorotrimetilsilan püskürtülür. Bir tehlikeyi önlemek için iğneyi davlumbazın iç duvarına doğrultun (Şekil 1B).
- Klorotrimetilsilanı kabın içine eşit şekilde yayın (adım 1.1.4'ten itibaren), ancak doğrudan gofret veya gofret içeren plakanın üzerine değil. Kabı kapatın ve gofret başına 5 dakika inkübe edin.
not: Gofret ilk kez klorotrimetilsilan ile kaplanıyorsa, her gofret için 1 saatlik bir inkübasyona izin verilmelidir.
- Gofretleri ve kabı 30 dk.
boyunca kimyasal davlumbazdan çıkarmayın.
Dikkat: Klorotrimetilsilan oldukça uçucudur.
- PDMS tabanını (Malzeme Tablosuna bakınız) 50 mL'lik bir tüpte tartın ve PDMS kürleme maddesini sırasıyla 16:1 oranında ekleyin (örn., 47.05 g baz ve 2.95 g sertleştirici). Düşük hızlı bir döndürücü kullanarak 10 dakika karıştırın.
- PDMS'yi gofret içeren her bir plakaya istenen yüksekliğe kadar dökün (Şekil 1C).
not: İnce mikroakışkan odaların (3-4 mm'ye kadar) kullanılması, kültür kabına yapışmayı artırır ve sızıntıyı önler.
- Tüm plakaları 2 saat boyunca bir vakumlu desikatör içinde bir araya getirin (Şekil 1E). Bu işlem, PDMS içinde sıkışan havayı uzaklaştırır, böylece hava kabarcıklarını ortadan kaldırır ve net, homojen bir kalıp oluşturur.
- Plakaları 3 saat (veya gece boyunca) 70 °C'de bir fırına yerleştirin (Şekil 1E).
not: Fırına yerleştirildiğinde plakalar düz olmalıdır.
- Epoksi kalıplarda PDMS döküm
not: Gofret hazırlama pahalı olduğundan, özel ekipman gerektirdiğinden ve kırılgan gofretlere zarar verebileceğinden, gofretlerin epoksi kopyalarını oluşturmak mümkündür. Kopyalar daha ucuz, daha dayanıklıdır ve mikroakışkan odaların seri üretimi için kullanılabilir.
- PDMS'yi (1.1.8-1.1.11'de açıklandığı gibi) orijinal gofret içine dökün ve sertleştirin.
- PDMS'nin fazla parçalarını çıkarın ve kesin, geriye yalnızca mikroakışkan elemanlar ve bunları mikroakışkan odalara işlemek için gereken işlevsel alan kalır.
- Toz birikmesini önlemek için PDMS'yi hemen kalın, yapışkan bantla sarın.
- Tüm PDMS'yi içine sığdıran doku kültürü sınıfı bir plastik tabak seçin ve çevresinde epoksi için yer bırakın. PDMS'den plastik tabağa olan mesafe 5 mm'den az olmalıdır.
- 10:1 oranında karıştırılmış az miktarda PDMS hazırlayın (baz: sertleştirici). Taze sıvı PDMS, katı PDMS'yi plastik plakanın altına yapıştırmak için kullanılacaktır.
- Plastik plakanın orta alt kısmına minimum miktarda sıvı PDMS uygulayın ve ardından yapışkan bandı PDMS'den çıkarın ve plastik kabın tabanına yapıştırın. Mikroakışkan elemanların yukarı baktığından emin olun.
- PDMS'nin 70 °C fırında 30 dakika kürlenmesine izin verin.
- Baz ve sertleştirici maddeyi bir test tüpünde sırasıyla 100:45 oranında karıştırarak epoksi reçineyi hazırlayın. Farklı epoksi reçineler farklı karışım oranlarına sahip olabilir. Normal 100 mm'lik bir plaka için gerekli hacim yaklaşık 40 mL'dir.
- Epoksinin, karışım gözle görülür şekilde homojen hale gelene kadar (yani, sıvıda görünür lif benzeri artefaktlar olmayana) bir döndürücüde 10 dakika boyunca iyice karışmasına izin verin.
- İçeride sıkışan hava kabarcıklarını çıkarmak için epoksi karışımını 400 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
- Santrifüjleme sırasında, duvarların etrafına ve kültür kabının açıkta kalan diğer tüm plastik parçalarına ince bir silikon yağ tabakası sürün. Bu, epoksinin bulaşık plastiği ile polimerleşmesini önleyecek ve protokol sonunda kürlenmiş epoksinin kolayca uzaklaştırılmasını sağlayacaktır.
- Epoksiyi, PDMS'yi tamamen kaplayana ve en az 5 mm ötesine geçene kadar yavaşça tabağa dökün. Tüp ile plaka arasında sıfır mesafe bırakarak epoksi içinde herhangi bir kabarcık oluşumunu önleyin. Plakayı, sonraki 48 saat boyunca hareket etmeyecek şekilde güvenli bir yere yerleştirin.
- 48 saat sonra epoksi tamamen kürlenmelidir. Son kürleme için plakayı önceden ısıtılmış 80 °C'de 3 saat fırına koyun.
- Kürlenmiş epoksiyi plakadan ve orijinal PDMS kalıbından, plakanın plastik duvarını kırılana kadar hafifçe çekerek çıkarın. Daha sonra epoksiden kolayca ayrılmalı ve soyulmalıdır.
- Ekstrakte edildikten sonra, kalan gresi yeni epoksi replikasından silin ve baş aşağı (yani, kopyalanan mikroakışkan elemanlar yukarı bakacak şekilde) yeni bir kültür kabına yerleştirin. Epoksi replika artık PDMS dökümü için hazırdır.
- Epoksi kalıptaki PDMS kalıntılarını veya kiri üflemek için basınçlı hava veya N2 kullanın ve izopropanol ile 2 kez durulayın. Üçüncü kez doldurun ve orbital çalkalayıcı bir plaka üzerinde 10 dakika inkübe edin. Kalıbı tekrar 3 kez izopropanol ile durulayın ve kalan sıvıyı atın. Hava veya N2 ile kurutun veya kuruyana kadar 70 °C fırına koyun.
not: İzopropanol ile çalışırken ve atarken güvenlik prosedürlerini izleyin.
- Döküm yapılana kadar kalıp plakalarını kapalı tutun. 1.1.8.-1.1.11 adımlarını izleyin.
- PDMS'nin bir MFC'ye delinmesi ve şekillendirilmesi (Şekil 2)
- Bir neşter kullanarak gofretlerin üzerindeki (+) işaretlerini takip ederek PDMS kalıbını plakadan kesin ve çıkarın. Kalıplar kırılgan olduğu için kuvvet kullanmayın (Şekil 2A).
- Deney düzeneğine bağlı olarak odaları delmek ve kesmek için eskiz üzerinde çizilen talimatları izleyin (Şekil 2B-F).
- Omurilik eksplant kültürü için (Şekil 2C, E), büyük MFC'nin distal tarafında iki adet 7 mm'lik kuyu açın. Kuyuları, kanal kenarları ile çakışacak şekilde yerleştirin. Proksimal tarafta, kanalın ortasına 7 mm'lik bir kuyu açın, minimum örtüşme ile, eksplantlar için yeterli boşluk bırakılacak şekilde. Proksimal kanalın iki kenarına iki adet 1 mm'lik ek delik açın. MFC'yi mikroakışkan elemanlar yukarı bakacak şekilde çevirin ve 20 G'lik bir iğne kullanarak, delinmiş 7 mm'lik kuyu üzerine üç küçük eksplant mağarası açın.
- Ayrışmış MN kültürü için (Şekil 2D, F), küçük bir MFC'nin iki kanalının kenarlarına dört adet 6 mm'lik kuyu açın.
- Doku kültürü kullanımı için MFC'nin sterilize edilmesi
- Tezgahın üzerine 50 cm uzunluğunda yapışkan bant bantları yayın. Yapışkan bandı (hem üst hem de alt yüzler) kaplamak için hazneyi bastırın ve geri çekin ve ham kiri çıkarın. Temiz hazneleri 15 cm'lik yeni bir tabağa yerleştirin.
not: Mikroakışkan elemanlar yukarı bakacak durumdayken doğrudan üzerine bastırmayın.
- Odaları bir orbital çalkalayıcı üzerinde 10 dakika boyunca analitik derece% 70 etanol içinde inkübe edin.
- Etanolü atın ve hazneleri bir doku kültürü davlumbazında veya 70 °C'de bir fırında kurutun.
- MFC'yi cam tabanlı bir tabağa yerleştirme
- Hazneyi doku kültürü sınıfı 35 mm/50 mm cam tabanlı bir tabağın ortasına yerleştirin ve PDMS ile tabak tabanının bağlanmasını sağlamak için kenarlara küçük bir kuvvet uygulayın. Cam tabanın kırılmasını önlemek için her zaman sağlam bir yüzeyin üzerine kuvvet uygulayın.
- 70 ° C'de 10 dakika inkübe edin. Plakaya yapışmayı güçlendirmek için bölmelere bastırın.
- UV ışığı altında 10 dakika inkübe edin.
- Kaplama ve kültürleme
- Her iki bölmeye de 1,5 ng/mL poli-L-ornitin (PLO) ekleyin. Kaplama ortamını doğrudan kanal girişine birkaç kez pipetleyerek FKÖ'nün kanallardan geçtiğinden emin olun.
- Hava kabarcıklarının varlığını kontrol etmek için mikroakışkan odayı 10x büyütmeli bir ışık mikroskobu altında inceleyin. Hava kabarcıkları mikro olukları tıkıyorsa, MFC'yi 2 dakika boyunca bir vakumlu desikatöre yerleştirin. Daha sonra, kanallara takılan fazla havayı, kaplama ortamını kanallardan pipetleyerek çıkarın. Gece boyunca kuluçkaya yatırın.
- Aynı şekilde gece boyunca inkübasyon için PLO'yu laminin (DDW'de 3 μg / mL) ile değiştirin.
- Kaplamadan önce, laminini bir nöronal kültür ortamı ile yıkayın.
2. Nöronal kültür kaplaması
- Omurilik eksplant kültürü
- Düz makas ve ince forseps kullanarak, bir E12.5 ICR-HB9: GFP fare embriyosundan bir omuriliği inceleyin. % 1 penisilin-streptomisin (P / S) içeren 1X HBSS çözeltisinde çalışın (Şekil 3A-C).
- Mikrodiseksiyon makası kullanarak meninksleri ve sırt boynuzlarını çıkarın (Şekil 3D).
- Omuriliği 1 mm kalınlığında enine kesitler halinde kesin (Şekil 3E). MFC'nin proksimal bölmesindeki tüm ortamı atın.
- Toplam hacmi 4 μL'lik bir pipet ile tek bir omurilik eksplantını alın. Eksplantı mağaraya mümkün olduğunca yakın enjekte edin ve proksimal kuyudan yanal çıkışlar (1 mm zımbalar) yoluyla fazla sıvıyı çekin. Eksplantlar proksimal kanala emilmelidir.
- Proksimal kuyucuğa yavaşça 150 μL omurilik eksplant ortamı (SCEX, bkz. Malzeme Tablosu ve Tablo 3) ekleyin.
- Omurilik eksplant kültürü bakımı
- Proksimal bölmeye SCEX besiyeri ve distal bölmeye zengin SCEX besiyeri (50 ng/mL BDNF ve GDNF içeren SCEX) ekleyin. Distal kuyucuklar (daha yüksek hacim) ve proksimal kuyu arasında kuyu başına en az 15 μL'lik bir hacim gradyanı koruyun.
- Ortamı her 2 günde bir yenileyin. Aksonların distal olarak geçmesi 3-5 gün kadar sürebilir.
3. Aksonal taşıma (Şekil 4A)
- Mitokondri ve asidik bölmelerin etiketlenmesi
- 100 nM Mitotracker Deep Red FM ve 100 nM LysoTracker Red içeren taze SCEX ortamı (veya ayrışmış MN için CNB) hazırlayın. 37 °C'de 30-60 dakika inkübe edin. Floroforları üst üste gelmediği sürece diğer renkler kullanılabilir.
- 3 kez ılık CNB/SCEX ortamı ile yıkayın. Plaklar görüntüleme için hazırdır.
- Canlı görüntüleme
- 3 sn aralıklarla, film başına toplam 5 dakika olacak şekilde 100 adet zaman atlamalı aksonal taşıma görüntüsü elde edin.
not: Bu çalışmada kullanılan görüntüleme sistemi, özel hücre görüntüleme yazılımı ile kontrol edilen, dönen disk konfokal ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop, 60x yağ merceği, NA = 1.4 ve bir EMCCD kamera içeriyordu. Filmler kontrollü bir ortamda 37 °C ve %5 CO2.
not: Deneye bağlı olarak daha uzun veya daha kısa zaman atlamalı filmler görüntülenebilir. Gerekirse bir gecede filmler bile kaydedilebilir. Bununla birlikte, film çekimi sırasında fototoksisiteyi ve ağartmayı azaltmak için pozlama süresini ve lazer gücünü ve ayrıca toplam görüntü sayısını azaltmaya çalışmak çok önemlidir.
