Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Malzemelerin hazırlanması
- Deneyi gerçekleştirmeden önce tüm aletleri ve ddH2O'yu bir otoklav kullanarak sterilize edin. Aletler arasında cerrahi makas, oftalmik makas, forseps, kaşık çekirdek bölücü, cam tabaklar (60-100 mm çapında) ve cam beherler bulunur ancak bunlarla sınırlı değildir.
- Krebs çözeltisini hazırlayın (Tablo 1): Kullanmadan önce tüm kimyasalları ddH2O ile çözün. CaCI2'yi ayrı ayrı çözün ve tortuyu önlemek için karıştırırken karışık çözeltiye yavaşça ekleyin.
- %10 fetal sığır serumu (FBS) ve %1 antibiyotik/antimikotik (100x) içeren F12 ortamından oluşan Durulama ortamını hazırlayın. 44.5 mL F12 ortamına 5 mL FBS ve 0.5 mL antibiyotik/antimikotik ekleyin.
- %2 B-27, %1 FBS, %1 L-glutamin, %1 antibiyotik/antimikotik (100x) ve %0.1 glia kaynaklı nörotrofik faktör (GDNF) içeren nörobazal A ortamını içeren nöron ortamı A'yı hazırlayın. 200 μL B-27, 100 μL FBS, 100 μL L-glutamin, 100 μL antibiyotik/antimikotik (100x) ve 10 μL GDNF (10 μg/mL) ekleyerek 9,5 mL nörobazal A ortamına ekleyin.
not: B-27, L-glutamin ve GDNF'nin tazeliğini sağlamak için kullanımdan sonraki bir hafta içinde nöron ortamı A'yı hazırlayın.
- Nöron ortamı A'nın hazırlanması ile aynı prosedürü kullanarak, ancak FBS eklemeden nöron ortamı B'yi hazırlayın.
- 20 mg kollajenaz tip II, 6 mg sığır serum albümini ve 200 μL antibiyotik/antimikotik (100x) 10 mL oksijene dayanıklı Krebs çözeltisi içinde çözerek sindirim çözeltisi 1'i hazırlayın.
- 1 mL %0.25 tripsin ile 4 mL Hank'in dengeli tuz çözeltisi ile seyrelterek sindirim çözeltisi 2'yi hazırlayın.
- Kaplamalı lameller ile bir tabak hazırlayın.
- Cam lamelleri 48 oyuklu bir kültür plakasına yerleştirirken laminer akış tezgahında forseps kullanın.
- Poli-D-lizini ddH2O ile poli-D-lizin stoğu olarak 0.1 mg / mL konsantrasyona seyreltin. Stoku –20 °C'de saklayın ve önce çözdürün
- Her lamel üzerine 40 μL poli-D-lizin stoğu ekleyin ve çözeltiyi oda sıcaklığında 10 dakika
inkübe edin
not: Farklı bazal alanlara sahip farklı plakalar için konsantrasyonu 4 μg/cm2'ye ayarlayın. Örneğin, 24 oyuklu bir plakadan bir oyuğun bazal alanı 2cm2 ise, bir kuyuya 80 μL poli-D-lizin stoğu aktarmalıyız. Hercm2, 4 μg poli-D-lizin içerecektir.
- 48 oyuklu plakadaki poli-D-lizini çıkarın ve lamelleri ddH2O ile üç kez durulayın.
- Plakanın susuz olduğundan emin olmak için plakayı laminer akış başlığında en az 30 dakika kurutun.
- Laminin kaplamadan önce plakayı 4 °C'de en fazla 1 gün saklayın. Uzun süreli saklama için plakanın -20 °C'de saklanması tercih edilir.
- Laminini 4 ° C'de çözün. Laminin stoğu olarak laminini ddH2O ile 50 μg / mL konsantrasyona seyreltin. Stoku –20 °C'de saklayın ve kullanmadan önce 4 °C'de çözdürün.
- Her bir lamel üzerine 100 μL seyreltilmiş laminin aktarmak için bir pipet kullanın ve laminini 4 °C'de 1 h.
inkübe edin
not: Farklı bazal alanlara sahip farklı plakalar için konsantrasyonu 5 μg/cm2'ye ayarlayın. Örneğin, 24 oyuklu bir plakadan bir oyuğun bazal alanı 2cm2 ise, 200 μL seyreltilmiş laminini bir kuyucuğa aktarın. Hercm2 5 μg laminin içerecektir.
- Laminin solüsyonunu çıkarın ve lamelleri ddH2O ile bir kez durulayın. Kazımayı önlemek için bu işlemi lamel kenarında gerçekleştirin.
not: Kaplamalı lameller 4 °C'de en fazla 2 hafta saklanabilir.
2. Mesane hasadı
- Beş haftalık Sprague-Dawley fareleri edinin.
- Stabil bir oksijen durumuna ve pH seviyesine ulaşmak için karbojeni (%95 oksijen, %5 CO2) bir buz banyosunda en az 30 dakika Krebs çözeltisine demleyin.
- Servikal çıkık yoluyla ötenaziden sonra, fareleri sterilizasyon için 30 saniye boyunca% 75 etanole batırın.
- Fareleri sterilize edilmiş bir cerrahi havluya yerleştirin ve karınlarını açığa çıkarın. Karın boşluğunu açın ve mesaneyi bir dizi makas ve forseps ile ortaya çıkarın.
- Mesaneyi nazikçe kaldırın ve çapraz kontaminasyonu önlemek için mesaneyi mesane boynundan başka bir makas ve forseps seti ile kesin. Hücre sağkalımını iyileştirmek için mesaneyi hızla soğuk, oksijene dayanıklı bir Krebs çözeltisine yerleştirin.
not: Mesane çıkarıldıktan sonra, nöronun hayatta kalma olasılığını artırmak için aşağıdaki işlemleri hızlı bir şekilde gerçekleştirin.
- Krebs çözeltisini üç cam tabağa ve cam beherlere ekleyin.
- Ön soğutma için bir buz banyosunda Krebs solüsyonu ile cam tabaklar ve beherler hazırlayın.
- Karışıklığı önlemek için bu kapları 1-3 numaralarıyla işaretleyin.
- Her cam tabağı forseps ve bir kaşık çekirdek bölücü ile eşleştirin.
- Cam tabak 1'de, mesaneyi oftalmik makasla kesin ve forseps ve bir kaşık çekirdek bölücü ile açın.
- Mesaneyi cam beherde 1 durulayın ve cam kabın 2 içine yerleştirin.
- Bir cam tabakta forseps ve oftalmik makas kullanarak doku yüzeyindeki yapışık yağları ortadan kaldırın 2.
- Mesaneyi cam kabında 2 durulayın ve cam kabın içine 3 yerleştirin.
- Ekzojen ataşmanları çıkarmak için forseps ve kaşık çekirdek bölücüyü kullanarak mesaneyi cam tabak 3 üzerine nazikçe kazıyın.
- Mesaneyi cam beher 3 içinde durulayın, mesaneyi 14 mL soğuk Krebs çözeltisi ile 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve numuneyi 356 x g ve 4 ° C'de 1 dakika döndürün.
- Kontaminasyonu azaltmak için önceki adımı Krebs solüsyonu ile diğer iki tüpte iki kez tekrarlayın.
3. İki aşamalı mesane sindirimi
- Mesaneyi santrifüj tüpünden 1 mL sindirim çözeltisi 1 içeren 2 mL'lik bir şişeye aktarın. Mesaneyi solüsyonda küçük parçalara (1 mm'den küçük) kesmek için oftalmik makas kullanın.
- Mesane solüsyonunu steril bir hücre kültürü kabında (100 mm çap) 9 mL sindirim solüsyonu 1 ile karıştırın. % 5 CO2, 37 ° C ve 200 rpm altında 1 saat boyunca çalkalanan bir inkübatörde 1. adım sindirimi gerçekleştirin.
- 1. adım sindirimden sonra, çözeltiyi 356 x g'da 4 ° C'de 8 dakika santrifüjleyin.
- Çürütme solüsyonunu 2 ön ısıtma için 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
- Santrifüjlemeden sonra, sindirim çözeltisi 1 içeren süpernatanı çıkarın ve hücre tortusunu hasat edin. Kalan bir miktar sıvıya izin verilir. Çözeltinin tamamen çıkarılması hücre kaybını teşvik edebilir.
- Hücre tortusunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde ılık sindirim solüsyonu 2 ile karıştırın ve karışımı 37 °C'lik bir su banyosunda 5 dakika boyunca sindirirken çalkalayın. 2. adım sindirimin 7 dakikasını aşmayın, aksi takdirde nöronlar yok olur.
- Sindirimden sonra, 10 mL soğuk durulama ortamı ile karışımdaki tripsini hemen devre dışı bırakın.
not: 0 °C–4 °C'de aşağıdaki adımları gerçekleştirin. Bir buz banyosu bu tür koşulları sağlayabilir.
- Santrifüjlemeden sonra hücre tortusunu 356 x g'da 4 ° C'de 8 dakika hasat edin. Kalan tripsin hücre büyümesine zarar verdiği için mümkün olduğunca fazla ortamı çıkarın.
- 3 mL nöron ortamı ile tortuyu nazikçe yeniden süspanse edin. Yüksek bir hayatta kalma oranı için çözelti içeren hücrelerde hava kabarcıklarının oluşmadığından emin olun.
- Karışım ortamını 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün
.
- Süzüntüyü 30 dakika boyunca bir buz banyosunda 30 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde tutun. Bu adım gerekli değildir, ancak önerilir.
- Hücreleri 8 dakika boyunca 4 ° C'de 356 x g'da santrifüjleme ile toplayın ve hücre peletlerini 1 mL nöron ortamı A'da nazikçe yeniden süspanse edin.
- Hazırlanan 48 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 500 μL hücre karışımı ekleyin.
- 37 ° C'de ve% 5 CO2'de bir inkübatörde kültür hücreleri.
- Serumsuz bir kültür sağlamak için tüm ortamı 1 saat içinde nöron ortamı B ile değiştirin.
- Her 3 günde bir nöron ortamı B'nin yarısını değiştirin.
not: Nöronlar, kültürden 5-7 gün sonra immünositokimyasal deneyler için hazırdır.
Tablo 1. Krebs çözelti bileşimi
| Malzemeler | Molarite (mM) |
| NaCI | 120 |
| KCI (Türkçe) | 5,9 |
| NaHCO3 | 25 |
| Na2HPO4·12H2O | 1.2 |
| MgCI2·6H2O | 1.2 |
| CaCI2 | 2,5 |
| glikoz | 11,5 |
