$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Çok bölmeli çiplerin hazırlanması ve kaplanması
- Bir biyo-güvenlik kabininde, çipi bir Petri kabına veya başka bir uygun steril kaba yerleştirin.
- Çipin sol üst kuyucuğuna 100 μL ön kaplama çözeltisi ekleyin ve ana kanaldan bitişik kuyuya akmasına izin verin.
not: Ön kaplama çözeltisi, çip içinde hava kabarcıkları sıkışma potansiyelini ortadan kaldırmak için mikroakışkan kanalları önceden kaplamak için kullanılır.
- Sol alt kuyuyu 100 μL ön kaplama solüsyonu ile doldurun. Çözeltinin mikro oluklardan akmasına izin vermek için 5 dakika bekleyin.
- Sağ üst kuyucuğa 100 μL ön kaplama çözeltisi ekleyin ve ana kanaldan bitişik kuyuya akmasına izin verin. Sağ alt kuyuyu 100 μL ön kaplama solüsyonu ile doldurun.
- Çözeltiyi her kuyudan aspire edin. Ana kanallardan sıvının çıkmasını önlemek için ana kanallardan aspire edin (Şekil 1A). Hemen sol üst kuyucuğa 150 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin. 1,5 dk.
bekleyin
Dikkat: Ekteki ana kanallardan tüm sıvıyı aspire etmeyin.
- Sol alt kuyucuğa 150 μL PBS ekleyin. Sıvıların mikro oluklardan akmasına izin vermek için 5 dakika bekleyin. Sağ üst kuyucuğa 150 μL PBS ekleyin. Sağ alt kuyucuğa 150 μL PBS ekleyin. 10 dakika bekleyin.
- İkinci bir PBS yıkaması için 1.5-1.6 adımlarını tekrarlayın.
- Ana kanallardaki kabarcıklar için bir doku kültürü mikroskobu altında çipi kontrol edin. Baloncuklar varsa, aşağıdaki prosedürleri gerçekleştirin. Kabarcık yoksa, adım 1.9'a geçin.
- PBS'yi kuyucuklardan aspire edin, pipet ucunu kanal açıklığından uzağa doğru açılandırın (Şekil 1A).
- 100 μL ön kaplama solüsyonunu, pipetin ucunu kanal açıklığına yakın bir açıyla üst kuyucuğa dağıtın (Şekil 1B). Kabarcıklar kanaldan alt kuyuya doğru hareket etmelidir. 1,5 dakika bekleyin.
- 1.3-1.8 adımlarını tekrarlayın.
- PBS'yi kuyucuklardan aspire edin, pipet ucunu kanal açıklığından uzağa doğru açılandırın (Şekil 1A).
- Çipin sol üst kuyucuğuna 100 μL 0.5 mg / mL poli d-lizin (PDL) ekleyin. 1,5 dakika bekleyin. Sol alt kuyuyu 100 μL PDL ile doldurun.
- Çipin sağ üst kuyucuğuna 100 μL PDL ekleyin. 1,5 dakika bekleyin. Sağ alt kuyucuğa 100 μL ekleyin.
- Petri kabını kapatın ve çipi 1 saat boyunca 37 °C'de bir inkübatöre yerleştirin.
- Fazla PDL'yi çıkarmak için PBS yıkama adımları 1.5-1.6'yı iki kez tekrarlayın.
- PBS'yi cihazdan aspire edin.
- Hemen çipin sol üst kuyucuğuna 100 μL hücre kültürü ortamı ekleyin. 1,5 dakika bekleyin. Sol alt kutuya medya ekleyin. Sağ üst kutuya medya ekleyin. 1,5 dakika bekleyin. Çipin sağ alt kuyusuna 100 μL orta ekleyin.
- Çipi, hücreleri plakalamaya hazır olana kadar 37 ° C inkübatöre yerleştirin.
2. Nöronları Çok Bölmeli Çiplere Tohumlamak
- ~ 12 × 106 hücre / mL.
bir yoğunluk elde etmek için ayrışmış sıçan hipokampal nöronlarının hücre süspansiyonunu belirlenen protokollere göre hazırlayın
not: 3 ile 12 × 106 hücre/mL arasında hücre süspansiyon yoğunluklarının kullanılması mümkündür. Daha düşük bir yoğunluk kullanılırsa, çipe eklenecek hücre süspansiyonunun hacmi arttırılabilir. Aşağıda açıklanan prosedür murin, ayrışmış kortikal veya hipokampal nöronlar için geçerlidir. Diğer nöron tipleri için optimal hücre yoğunlukları değişebilir.
- Çipin her bir oyuğundaki ortamın çoğunu çıkarın ve her bir oyukta yaklaşık 5 μL bırakın. Ana kanallardan sıvının çıkmasını önlemek için ana kanallardan aspire edin (Şekil 1A).
Dikkat: Ekteki ana kanallardan sıvı aspire etmeyin. Ana kanallardan sıvı aspire edilirse hava kabarcıkları çip içinde sıkışabilir.
- Sağ üst kuyucuğa 5 μL hücre süspansiyonu ve sağ alt kuyucuğa 5 μL hücre süspansiyonu daha yükleyin (toplam ~ 120.000 hücre). Hücreleri ana kanala yakın bir yere dağıtarak yükleyin (Şekil 1B). Nöronların ana kanalda olduğundan emin olmak için mikroskop altında kontrol edin. Hücrelerin bağlanmasına izin vermek için 5 dakika bekleyin.
not: Nöronlar her iki bölmeye de yüklenebilir. Açıklama amacıyla, somatik bölme sağ taraftaki ana kanaldır, ancak her iki bölme de somatik bölme olarak kullanılabilir. Çip başına 60.000 hücreye kadar daha düşük hücre yoğunluklarının kullanılması mümkündür. Yukarıda tarif edilenden daha az hücreli bir hücre süspansiyonu ile kombinasyon halinde somatik bölmenin her bir oyuğuna 10 μL'ye kadar hücre süspansiyonu eklenebilir.
- Sağ üst ve alt oyukların her birine yaklaşık 150 μL nöronal kültür ortamı ekleyin ve ardından her üst ve alt sol oyuğa 150 μL ortam ekleyin. Çipi %5 CO2 37 °C inkübatörde nemlendirilmiş tepsiye yerleştirin.
- 24 saat sonra, ortamı kuyulardan çıkararak bir ortam değişikliği yapın. Ana kanalın dolu kaldığından emin olun. Her bir üst kuyucuğa 150 μL ortam ekleyin, ardından alt kuyucukları doldurun.
- Çipi istenen gün sayısı boyunca inkübatöre geri yerleştirin.
not: Açık pembe kaldığından emin olmak için medyayı birkaç günde bir izleyin. Ortam sarımsıysa, %50'sini yeni ortamla değiştirin. Sıvı seviyesi düşükse, buharlaşmayı önlemek için talaşların yeterli nem ve uygun ikincil muhafazasını sağlayın. İkincil muhafaza ve/veya çipi içeren çanağın politetrafloroetilen (PTFE)-FEP film ile kaplanması kullanılarak ortam değişikliklerinin en aza indirilmesi veya ortadan kaldırılması mümkündür.
