Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Deneyler için Çözümler Hazırlayın
- Hücre dışı matris (ECM) kaplama çözeltisini hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakın): ECM karışımını buz üzerinde çözdürün. ECM karışımını bazik kültür ortamında (nörotrofik faktörler veya Fetal Sığır Serumu (FBS) olmadan) 1:10 oranında seyreltin ve buz üzerinde saklayın.
- Kültür ortamını hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız): FBS veya Beyin Kaynaklı Nörotrofik Faktör (BDNF) içermeyen bir Nörobazal ortam stoğu hazırlayın. Hücre kültürüne eklemeden hemen önce nörobazal ortamı taze FBS (% 10) ve BDNF (5 ng / ml) ile destekleyin.
- Hücre dışı çözeltiyi hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
2. MEA'ların Yıkanması ve Sterilizasyonu
NOT: Deneyler için kullanılan MEA'lar, dikdörtgen bir ızgarada düzenlenmiş 68 elektrot içerir (Şekil 1E). Her elektrot, merkezden merkeze 200μm'lik bir aralıkla 40 x 40 μm2'lik bir boyuta sahiptir. Elektrotlar platinden yapılmıştır. Elektrotlar, indiyum kalay oksitten yapılmış bir devre ile ilgili kontaklara bağlanır. Bu devre 5 μm'lik bir SU-8 tabakası ile yalıtılmıştır. Sağlayıcı ile ilgili ayrıntılar için Malzeme tablosuna bakın. Diğer MEA düzenleri bu deneyler için uygun olabilir.
- Yeni MEA'lar için: 30 saniye boyunca %70 etanole batırarak durulayın ve 30 saniye boyunca damıtılmış su ile yıkayın. Laminer akış başlığında çalışın.
- MEA'yı laminer akış başlığında 30 dakika kurumaya bırakın.
- Her MEA'yı ayrı bir steril Petri kabına (35 mm x 10 mm) koyun ve folyo ile kapatın. MEA'lar kullanılana kadar saklanabilir.
- Kullanılmış MEA'lar için: MEA'ları, biyolojik materyali çıkarmak için RT'de orbital çalkalayıcı üzerinde 1 ml enzimatik çözelti (Malzeme Tablosuna bakınız) içeren bir Petri kabında (35 mm x 10 mm) inkübe edin. Ardından adım 2.1.
'deki gibi devam edin
not: Kauçuk kaplı uçlara sahip forseps kullanarak MEA'ları dikkatli bir şekilde tutun.
3. Kültür Deneyleri için MEA'ların Hazırlanması
- Sızdırmazlık folyosunu çıkarın ve MEA'yı tüm deney için Petri kabında (35 mm x 10 mm) bırakın.
- MEA'ları 1.1'de hazırlanan solüsyonla kaplayın: Her bir MEA'ya tüm elektrot alanını kaplayacak şekilde 50 μl kaplama solüsyonu pipetlemek için soğuk 200 μl'lik bir pipet ucu (-20 °C'de saklanır) kullanın.
- MEA'ların RT'de 30 dakika ila 1 saat kaplamasına izin verin.
- Bir pipet kullanarak kaplama solüsyonunu çıkarın. % 10 FBS ve 5ng / ml BDNF ile desteklenmiş 100 μl kültür ortamı uygulayın ve dokuyu kaplayana kadar RT'de bırakın.
- Kaplanmış MEA'ları içeren 2 Petri kabını büyük bir petri kabına (94 mm x 16 mm) yerleştirin ve nemlendirme için 1,5 ml Fosfat Tamponlu Salin (PBS) içeren üçüncü bir küçük petri kabı ekleyin.
not: PBS içeren küçük bir petri kabı (adım 3.5) eklemek, kültür ortamının buharlaşmasını önemli ölçüde en aza indirmek için çok önemlidir.
4. Spiral Ganglion Diseksiyonu
NOT: Brüt diseksiyon, laminer akış başlığının dışında yapılabilir (Adım 4.1 ila 4.4). İnce diseksiyon için steril koşullar (laminer akış başlığı) zorunludur (adım 4.5'ten itibaren).
- Hayvanları (5-7 günlük fareler) önceden anestezi almadan dekapitasyon ile ötenazi yapın.
- % 70 etanol püskürterek kafayı sterilize edin.
- Başı tutarak, cilt ile kafatası arasındaki bağlantıyı sagital çizgi boyunca keskin/keskin bir makasla kesin.
- Kafatasını sagittal olarak kesin ve keskin/künt makas kullanarak beyni çıkarın.
- Temporal kemikleri kafatasından kesin ve bunları steril, buz gibi Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) içeren bir petri kabına koyun.
- Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, ince forseps kullanarak timpanik bülleri inceleyin ve iç kulağı izole edin.
- İnce forseps kullanarak koklea kemiğini çıkarın.
- Spiral ganglionun (SG) bazal kısmını ve SV'yi forseps ile tutarak ve SV'yi tabandan apekse doğru yavaşça çözerek spiral ligament ve stria vaskülarisi (SV) birlikte çıkarın
- Corti (OC), SG ve modiolus organını izole edin (Şekil 1A-C).
- Forseps ile SG ve OC'nin bazal kısmını tutarak ve OC'yi tabandan apekse doğru yavaşça çözerek OC'yi SG ve modiolustan ayırın.
- Forseps ve bir mikro neşter kullanarak hala modiolusa (Şekil 1D) bağlı olan spiral gangliondan lateral eksplantları (200 ila 500 μm çapında) kesin.
5. MEA'larda Spiral Ganglion Eksplant Kültürü
- Daha önce 100 μl kültür ortamı ile hazırlanmış MEA üzerindeki elektrotların yanına iki spiral ganglion eksplantı yerleştirin.
- Corti organını elektrot alanından yaklaşık 5 mm uzağa yerleştirin.
- Dokuya zarar vermekten kaçınırken eksplantları ve Corti organını MEA'ya sabitlemek için forseps kullanın.
- MEA'ları dikkatlice inkübatöre yerleştirin ve 37 ° C ve% 5 CO2'de kültürleyin. Ertesi gün, eksplantların MEA.
not: Eksplantlar O/N bağlanmamışsa, önümüzdeki birkaç gün içinde bunu nadiren yapacaklardır. OC, trofik/nörotrofik destek için kültüre bitişik olarak yerleştirilir.
- Art arda 5 gün boyunca günlük% 10 FBS ve BDNF içeren 100 μl kültür ortamı ekleyin.
- 6. günde,% 10 FBS ve 5ng / ml BDNF içeren 2 ml kültür ortamı ekleyin ve dokuyu 13 gün daha kültürleyin.
