>1. Yeniden programlama için astrositlerin tohumlanması
NOT: Aşağıdaki adımlar, güvenlik seviyesi 1 (SL1) olan bir biyolojik güvenlik kabini altında gerçekleştirilmelidir.
- Poli-D-lizin kaplı cam lamellerle 24 oyuklu plakaları, daha önce kültür şişelerinin hazırlandığı şekilde hazırlayın. İhtiyaç duyulan plaka sayısını belirlemek için, astrositlerin 24 oyuklu bir plakada oyuk başına 5-5.5 x 104 hücre yoğunluğunda kaplandığını düşünün. Genellikle, doğum sonrası 2. gün (P2) farelerinden altı omuriliği izole etmek, yaklaşık 1 x 106 hücre verir.
- Kültürlenmiş astrositleri içeren T25 kültür şişelerinden aspire edin ve bir kez 1x Fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. 0.5 mL% 0.05 Tripsin / Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyerek astrositleri kültür şişesinden ayırın ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Hücreleri kültür şişesi yüzeyinden serbest bırakmak için şişenin yan tarafına hafifçe vurun ve 10X büyütme kullanarak parlak alan mikroskobu altında ayrılmayı kontrol edin.
- 2.5 mL astrosit kültür ortamı ile tripsinizasyonu durdurun ve hücre süspansiyonunu 15 mL tüplerde toplayın. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve hücreleri 1 mL astrosit kültür ortamında yeniden süspanse edin. Bir hemositometre veya otomatik hücre sayma sistemi kullanarak hücre konsantrasyonunu hesaplayın.
- Hücre sayısına bağlı olarak, mL başına 1-1.1 x 105 hücrelik bir çözelti elde etmek için hücre süspansiyonunu taze astrosit ortamı ile seyreltin. Ortamı, faktör başına 10 ng / mL'de epidermal büyüme faktörü (EGF) ve bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ile destekleyin. Önceden hazırlanmış 24 oyuklu plakaların ve 37 ° C ve% 5 CO2'de kültür hücrelerinin her bir oyuğuna 5-5.5 x 104 hücreye eşdeğer 500 μL hücre süspansiyonu ekleyin.
2. Transkripsiyon faktörlerinin zorla ifadesi
NOT: Protokole devam etmeden önce, deneyin uygun şekilde tasarlanması esastır. Özellikle, yeniden programlama için her zaman negatif bir kontrol, yani hiçbir yeniden programlama faktörünün ifade edilmediği bir koşul dahil etmek önemlidir. Örneğin, yeniden programlama faktörü ve bir raportör (örneğin, yeşil floresan proteini (GFP), DsRed) için cDNA'yı taşıyan vektörler kullanıldığında, negatif kontrol, yalnızca raporlayıcıyı taşıyan aynı vektör tarafından temsil edilir. Farklı raportörleri taşıyan birden fazla faktörü ifade ederken, negatif kontrol buna göre ayarlanmalıdır.
- Kaplamadan sonraki gün, hücrelerin lamellere yapıştığından emin olmak için 24 oyuklu plakaları inceleyin.
- Deneysel amaca ve mevcut kaynaklara dayanarak, yeniden programlama faktörlerinin zorla ifadesi, viral transdüksiyon (bkz. adım 2.3) veya DNA transfeksiyonu (bkz. adım 2.4) ile sağlanabilir.
NOT: Retrovirüs veya lentivirüs kullanımı, hükümet yetkililerinin onayını gerektirir ve güvenlik seviyesi 2 (SL2) olan bir laboratuvarda biyolojik güvenlik kabini altında gerçekleştirilmelidir.
- Aşağıda açıklandığı gibi ilgilenilen yeniden programlama faktörlerini ifade etmek için genetik bilgiyi taşıyan retrovirüs veya lentivirüs ile hücreleri dönüştürerek astrositleri yeniden programlayın.
- 1 μL hücre süspansiyonunu doğrudan astrosit ortamına ekleyerek 1 x 1010-1 x10 12 partikül / mL'lik yüksek virüs titresine sahip hücreleri dönüştürün. Bu, yüksek bir enfeksiyon oranı sağlar. Deneyin amacına bağlı olarak, bölüm 3'e geçmeden önce hücreleri viral partiküller içeren astrosit ortamı ile 24-36 saat boyunca 24-36 saat kültürleyin.
NOT: Transgenlerin ekspresyonunu yönlendirmek için farklı promotörler kullanılabilir (ayrıca bakınız Temsili Sonuçlar). Yapısal promotörler {ör., sitomegalovirüs (CMV), tavuk β-aktin (CAG)}, transgenin ekspresyonunu indüklenebilir promotörlerden daha erken indükler; Bununla birlikte, her iki promotör türü de hücreleri nöronlara yeniden programlamak için başarıyla kullanılmıştır.
- DNA plazmitleri, aşağıda tarif edildiği gibi DNA transfeksiyonu yoluyla astrositlere de sokulabilir.
not: Bu, SL1 için onaylanmış bir biyolojik güvenlik kabini altında yapılabilir.
- Transfeksiyondan önce, transfeksiyon reaktifini, istenen yapıların bir plazmit DNA'sını, taze astrosit ortamını ve serumla indirgenmiş ortamı elde edin (bkz. Malzeme Tablosu). 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunun 300 μL serumla indirgenmiş ortam gerektirdiğini göz önünde bulundurarak gerekli serumla indirgenmiş ortam miktarını hesaplayın (Malzeme Tablosuna bakınız). 50 mL'lik bir tüpe uygun miktarda serumu azaltılmış ortam ekleyin ve 37 ° C'ye ısıtın.
- Serumla indirgenmiş ortam sıcak olduğunda, tüm oyuklardan astrosit ortamını aspire edin ve 50 mL'lik bir tüpte toplayın. Ayrılan hücreleri çıkarmak için toplanan astrosit ortamını 0.45 μM'lik bir şırınga filtresi ile filtreleyin.
- Oyuk başına 1 mL astrosit ortamı eklemek için yeterli bir çözelti elde etmek için filtrelenmiş ortama eşit hacimde taze astrosit ortamı ekleyin. Astrosit şartlandırılmış ortamı kullanıma kadar inkübatörde 37 °C'de tutun (adım 2.4.9).
not: Kültür ortamı, kültürün yaşayabilirliğini destekleyen birkaç salgılanan faktör içerdiğinden yeniden kullanılır.
- Her bir oyukluğa 300 μL önceden ısıtılmış serumla azaltılmış ortam ekleyin ve 24 oyuklu plakayı inkübatöre geri yerleştirin.
- DNA ve serumla indirgenmiş ortamdan oluşan çözelti A'yı hazırlayın. Her kuyucuk için toplam 0.6 μg DNA kullanın ve bunu 50 μL serumla indirgenmiş ortama ekleyin. Çözelti A'yı kullanılana kadar oda sıcaklığında saklayın.
NOT: Tipik olarak, koşul başına teknik bir üçlü kalem dikkate alınır. Bu nedenle, 3.5 reaksiyon için yeterli bir karışım hazırlanır (ör., 24 oyuklu bir plakanın üç oyusunu geçmek için yeterli materyali sağlamak için 175 μL serumla indirgenmiş ortamda seyreltilmiş 2.1 μg toplam DNA).
- Transfeksiyon reaktifi ve serumla indirgenmiş ortamdan oluşan B çözeltisini hazırlayın. Her kuyucuk için, 50 μL serumla indirgenmiş ortama 0.75 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin. Bu çözelti tüm transfeksiyon koşullarında ortak olduğundan, transfeksiyonlar arasındaki değişkenliği azaltmak için toplu olarak hazırlayın.
- Çözelti B'yi oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Çözelti B'yi çözelti A'ya 1: 1 oranında damla damla ekleyin ve hafifçe karıştırın. Girdap yapmayın. A + B çözeltisini davlumbazın altında oda sıcaklığında 20-30 dakika inkübe edin.
- Tüm transfeksiyon koşulları için 2.4.5-2.4.7 adımlarını tekrarlayın. 20-30 dakika sonra, 100 μL'lik bir son hacim için her bir oyuğa damla damla A + B çözeltisi ekleyin. Plakayı hafifçe sallayın ve hücreleri 4 saat boyunca 37 ° C'de inkübatöre geri yerleştirin.
- 4 saat sonra, transfeksiyon ortamını çıkarın ve adım 2.4.3'te hazırlanan önceden ısıtılmış astrosit şartlandırılmış ortamdan 1 mL ekleyin. Deneyin amacına bağlı olarak, bölüm 3'e geçmeden önce hücreleri 36-48 saat koruyun.
3. Astrositlerin yeniden programlanması (7 günlük analiz)
- 49 mL bazik kültür ortamına 1 mL B27 takviyesi ekleyerek nöronal farklılaşma ortamı hazırlayın. 24-48 saat sonra, hücrelerin transdüksiyon veya transfekte edilip edilmediğine bağlı olarak (sırasıyla adım 2.3 ve 2.4'e bakınız), astrosit ortamını oyuk başına 1 mL nöronal farklılaşma ortamı ve 37 ° C'de kültür hücreleri ve% 9 CO2.
NOT: % 9 CO2 inkübatörü yoksa, hücreler% 5 CO2'de de tutulabilir. Bununla birlikte, nöronal yeniden programlama bu koşullar altında daha verimlidir.
- İsteğe bağlı: Yeniden programlama verimliliğini artırmak için, astrosit ortamını farklılaşma ortamına değiştirirken nöronal farklılaşma ortamını Forskolin (30 μM'lik nihai konsantrasyon) ve Dorsomorfin (1 μM'lik nihai konsantrasyon) ile destekleyin. Forskolin ve Dorsomorphin ile hücreleri tedavi etmeyi tercih ederken, ilk tedaviden 2 gün sonra ikinci bir Dorsomorphin dozu sağlayın. Bu ikinci tedaviyi doğrudan kültür ortamına ekleyin.
- Murin astrositlerinin nöronal hücrelere doğrudan yeniden programlanması normalde ortamın değiştirilmesinden sonraki 7 gün içinde gerçekleşir (Şekil 1). Bu nedenle, nöronal yeniden programlamanın başlamasından 7 gün sonra, aşağı akış analizi için hücreleri sabitleyin veya toplayın.
