$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Stimülasyon için sağlam işitsel sinir kökü ile beynin çıkarılması
>NOT: Bu deneyler için fareler, C57BL/6J arka plan üzerinde ChAT-IRES-Cre transgenik farelerin tdTomato raportör farelerle (Ai14) çaprazlanmasıyla elde edildi. Histoloji ve elektrofizyoloji için kullanılan fareler, farelerde P12 civarında olan işitme sonrası başlangıçlı (P14-P23) idi. Yamuk gövdesinin (VNTB) ventral çekirdeğinde tdTomato eksprese eden nöronlar, daha önce bu fare hattında medial olivoklear (MOC) nöronlar olarak karakterize edilmiştir.
- Ötenazi yapın (ör., CO2 boğulması) ve onaylanmış kurumsal prosedürleri kullanarak hayvanın kafasını dekapitasyon.
- Bir tıraş bıçağı kullanarak, kafatasının orta hattındaki cildi burundan boynun arkasına kadar kesin. Kafatasını ortaya çıkarmak için cildi soyun.
- Küçük bir makas kullanarak, kafatasının tabanından (omuriliğin yanındaki kuyruk ucu) başlayıp buruna doğru devam ederek orta hattan kafatasında bir kesi yapın.
- Lambda dikişinde, kafatasında orta hattan, her iki tarafta kulağa doğru yanal olarak kesikler yapın. Beyni ortaya çıkarmak için kafatasını geriye doğru soyun.
- Rostral uçtan başlayarak, küçük bir laboratuvar spatulası veya künt forseps ile beyni kafatasından nazikçe kaldırın. Optik siniri kesin ve ventral yüzeyi açığa çıkararak beyni geriye doğru nazikçe çalıştırmaya devam edin.
- Trigeminal sinirleri, beyin sapının ventral yüzeyine yakın ince forseps ile sıkıştırarak kesin.
not: Bunu dikkatlice yapın, çünkü vestibülokoklear sinir bunun hemen altında yer alır ve nihai stimülasyon için sağlam olması gerekir.
- Preparasyonu soğuk dilimleme çözeltisi ile doldurulmuş bir cam Petri kabına yerleştirin. Çanağı diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Yavaşça karbojen ile köpürtün.
- Fasiyal siniri beyin sapına yakın kesin ve vestibülokoklear siniri açığa çıkarın.
- İnce forseps kullanarak, uçları vestibülokoklear sinirin kafatasından mümkün olduğunca çıktığı foramina itin ve sinir kökünü beyin sapına bağlı bırakarak siniri kesmek için sıkıştırın. Bunu diğer tarafta tekrarlayın.
- Her iki sinir kökü de serbest kaldığında, meninksleri ve damar sistemini yamuk gövdesinin yakınındaki beyin sapının ventral yüzeyinden çıkarın.
- Kalan kraniyal sinirleri ve bağ dokusunu sıkıştırarak beyni kafatasından tamamen kurtarın, mümkünse kalan omuriliği korumaya özen gösterin.
2. Beyni sahneye bloke et ve monte et (manyetik disk)
- Beyni optik kiazma seviyesinde bloke ederek beynin yüzeyini sahneye sabitlemek için hazırlayın.
- Ventral yüzey yukarıdayken, omuriliği nazikçe hareketsiz hale getirmek için künt bir alet kullanarak beyni stabilize edin, böylece bir sonraki adımda beyin eğilmez.
- Optik kiazma seviyesinde, beynin içinden tabağın dibine kadar sokarak beyni bloke etmek için düzlemi oluşturmak için açık forseps kullanın. Forsepsleri dikeyden yaklaşık 20°'lik bir açıyla yerleştirin, böylece uçlar beynin kaudalinin dorsal yüzeyinden optik kiazmaya çıkar.
- Tıraş bıçağını kullanarak forsepsleri kesin.
- Beyni sahnenin yüzeyine yapıştırın.
- Beyni desteklemek için küçük bir blok (~ 1 cm3)% 4 agar hazırlayın.
- Sahneye küçük bir damla yapıştırıcı yerleştirin ve hem beyin hem de agar bloğunun yapıştırılabilmesi için bir dikdörtgen şeklinde yayın.
- Forseps kullanarak beyni dikkatlice kaldırın ve bir kağıt havlunun kenarını kullanarak fazla sıvıyı hafifçe vurun. Tıkalı yüzeyi tutkalın üzerine yerleştirin, dilimleme sırasında ventral yüzey bıçağa doğru olacaktır.
- Dilimleme sırasında desteklemek ve uygun beyin pozisyonunu (yani açısı) sağlamak için agar bloğunu beynin sırt yüzeyine nazikçe itin.
3. Kama dilimi oluşturmak için beyni dilimleyin
NOT: Kalın tarafında koklear sinir kökü ve ince tarafında medial olivoklear (MOC) nöronları ve yamuk cisminin (MNTB) medial çekirdeği olan bir vibratom kullanarak bir beyin dilimi hazırlayın.
- Bağlı beyinle birlikte manyetik diski sahne tabanına yerleştirin ve beynin ventral yüzeyi bıçağa doğru bakacak şekilde dilimleme odasına yerleştirin.
- Hazneyi buz gibi soğuk dilimleme solüsyonu ile doldurun ve karbojen ile köpürtün.
- Bıçağı çözeltinin içine indirin ve dilimlerin simetrik olduğundan emin olmak için ilgilenilen bölgeye kaudal dilimler kesin. Dilimler asimetrik görünüyorsa, simetri elde etmek için sahneyi hafifçe eğin.
not: 0,05-0,10 mm/sn arasındaki bıçak hızları, sağlıklı dilimleri kesmek için etkiliydi ve hayvan yaşına ve beyin bölgesine bağlı olarak değişebilir.
- Dilimler simetrik hale geldikten sonra, sahneyi ~15° (sahne alanı tabanındaki yaklaşık 3 eşmerkezli halkaya karşılık gelir) bir tarafa kaydırın.
not: Sahneyi, dilimde korumak istediğiniz işitme siniri kökünden uzağa kaydırın.
- İşitme siniri kökü bir tarafta yüzeye yakın olana ve diğer tarafın yüzeyinde fasiyal sinir görülebilene kadar dikkatli bir şekilde dilimlemeye devam edin.
- Sahneyi 15° geri kaydırarak orijinal konumuna getirin.
- Bıçağı dokudan uzaklaştırın ve ince tarafın yan kenarı bıçağa bakacak şekilde sahne tabanını 90° döndürün. Bıçağı birkaç yüz mikron indirin ve ardından bıçağı yavaşça dokunun kenarına yaklaştırın. Bıçak yan kenara değene kadar bunu tekrarlayın. Bıçağı, dilimin ince kenarının istenen kalınlığına indirin, burada iki yüz mikron daha ekleyin.
not: Elde edilen dilim, yama klemplemenin yapılacağı taraftaki yamuk gövdesinin (VNTB) ventral çekirdeği seviyesinde ideal olarak ~ 300 mm kalınlığındadır.
- Bıçağı dokudan uzaklaştırın ve sahne tabanını ventral yüzey ona bakacak şekilde geriye doğru döndürün.
- Kama diliminin rostral yüzeyini belirleyen kesimi yapın. Dilimi bir parça arayüz kağıdına (1 cm, 2) kaudal yüzey aşağı doğru aktarın. Dilimi geri kazanım için inkübasyon odasına veya başka bir uygun inkübasyon aparatına taşıyın (35 ° C'de 30 dakika).
not: Fasiyal sinir, rostral yüzeydeki dilimin her iki hemisferinde de görünür olmalıdır (bkz. Şekil 1B).
