Altın Nanoçubuklar Kullanılarak Nöronal Hücre Farklılaşmasının Uyarılması

Özet

Kaynak: Paviolo., et al. Nöronal hücrelerin altın nanoçubuk destekli optik stimülasyonu. J. Vis. Uzm. (2015).

Bu video, sinir hücrelerini altın nanoçubuklara ve βIII-tubulin tarafından desteklenen hücre projeksiyonları oluşturan lazer ışığına maruz bırakarak nöronal farklılaşmayı teşvik etmek için bir tekniği göstermektedir. Epifloresan mikroskobu ile tübülin ve hücre çekirdeğinin boyanması ve gözlemlenmesi, nanoçubukların nöronal farklılaşmadaki etkinliğini gösteren hücre büyümelerini ortaya çıkarır.

Protokol

1. NG108-15 Nöronal Hücre Hattı Kültürü ve Farklılaşması

1. Hücre kültürü ortamı için, %10 (a/h) fetal buzağı serumu (FCS), %1 (a/h) L-glutamin, %1 (a/h) penisilin/streptomisin ve %0.5 (a/h) amfoterisin B.
   içeren 500 ml steril Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı (DMEM) hazırlayın Not: Takviyeler alınabilir, -20 °C'de saklanabilir ve gereken günde ortama eklenebilir. Hücre kültürü ortamı steril bir durumda en fazla 1 ay süreyle soğutulabilir.
2. Hücre farklılaşma ortamı için, %1 (a/h) L-glutamin, %1 (a/h) penisilin/streptomisin ve %0,5 (a/h) amfoterisin B içeren 50 ml steril DMEM hazırlayın.
3. Nemlendirilmiş atmosfere sahip bir inkübatörde polistirenden yapılmış T75 şişelerinde 10 ml hücre kültürü ortamında NG108-15 nöronal hücreleri büyütün (37 ° C'de% 5 CO2). Normalde, 3-4 gün içinde hazır olmak için her şişede 1.5-2 × 10⁵ hücre tohumlayın. Hücre kültürü ortamını her iki günde bir değiştirin.
   Not: Genetik sürüklenmeleri veya varyasyonları önlemek için, deneyler için 21. bölümden daha eski hücreleri kullanmayın.
4. Kültürde% 70-80 birleştiğinde, ortamı ılık taze bir hücre kültürü ortamı ile değiştirin. Birleşen şişenin dibini hafifçe vurarak hücreleri mekanik olarak ayırın. Tripsin kullanmayın.
5. Hücre süspansiyonunu 600 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve hücre peletini 2 ml ılık hücre farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin.
6. Tohum 2 × 10⁴ hücre /^cm2 2 200 μl hücre farklılaşma ortamı ile bir doku kültürü polistiren 96 oyuklu plakada. Deneyi %5 CO2 / 37 °C'de 1 gün inkübe edin.
7. 2. günde 3.2 × 10⁹ - 4.2 ×^{10 10} parçacık / ml altın nanoçubuk (Au NR) çözeltisi ekleyin ve 24 saat daha inkübe edin. Kontrol deneyleri için parçacıkları eklemeyin.
   Not: Alternatif bir kontrol olarak, iyi farklılaşmış bir tepe absorpsiyon dalga boyuna sahip altın nanopartiküller (Au NP'ler) karşılaştırma amacıyla kullanılabilir, Daha tutarlı bir hücre davranışı için hücre yoğunluğunu sabit tutun ve hücre tohumlamadan önce kuyu yüzeyini değiştirmeyin.

2. Nörit Büyüme Artışı

1. Lazeri tek modlu bir fiber optik ile birleştirin (sayısal açıklık = 0.13) ve bir fiber konektörle sonlandırın (FC konektörleri uygundur ve yaygın olarak bulunur). Çıkış lazer gücünü standart bir güç ölçer ile ölçün. En etkili sonuçları elde etmek için, lazerin tepe dalga boyunu NR'lerin plazmon rezonans zirvesiyle eşleştirin.
2. NR inkübasyonunu takip eden 3. günde, FC konektörünü kuyuya sabitleyin. Farklı lazer güçleri için numuneleri ve kontrolleri RT'de 1 dakika boyunca sürekli dalgada ışınlayın. Kültürün% 5 CO2 / 37 ° C'de 3 gün daha ilerlemesine izin verin. En az 3 bağımsız ölçüm için lazer ışınlamasını tekrarlayın.
   Not: Uygulamaya bağlı olarak farklı ışınlama süreleri ve darbe frekansları seçilebilir.
3. Lazeri ışın çapı ve lazer ışınımı (W∙cm-2) açısından karakterize edin.
   1. Standart bir tek modlu fiber için, NA = n∙sinθ kullanın, burada n, kullanılan ortamın kırılma indisidir ve θ, fiberden çıkan ışık konisinin yarım açısıdır (bkz. Şekil 1A). Trigonometriden, r = tanθ∙d, burada r ışın yarıçapı ve d, lif ile numune arasındaki mesafedir. FC konektörü kuyunun çapıyla eşleşir, bu nedenle numuneyi d = 2,70 ± 0,20 mm mesafede aydınlatır. Işık sudaki liften çıkar (n = 1.33), r = tan(sin-1(NA/n))∙d verir.
   2. İkinci denklemi kullanarak, hedefteki lazer ışını yarıçapını, karşılık gelen ışın alanını ve ortalama lazer ışınımını (lazer gücünün ışın alanına bölünmesi) hesaplayın (Şekil 1B'deki örnek grafiğe bakın). Bu değerler, aydınlatılan alan üzerindeki ortalama ışınımı temsil eder.
   3. Genel hata yayılımı teorisi ile ölçümler için hataları değerlendirin.
      Not: FC konektörü ile numune arasındaki mesafe, uygun yazılım (örn. ImageJ) kullanılarak deneysel düzenlemenin ve görüntünün sonradan işlenmesinin fotoğraflarıyla ölçülebilir.
4. 5. günde, hücre farklılaşma ortamını deneylerden çıkarın ve numuneleri 10 dakika boyunca% 3.7 (h / h) formaldehit çözeltisi ile sabitleyin, daha sonra hücreleri% 0.1 (h / h) Triton X-100 ile 20 dakika boyunca geçirgen hale getirin.
5. Reaksiyona girmemiş protein bağlanma bölgelerini bloke etmek için numunelere 60 dakika boyunca% 3 (a / h) sığır serum albümini (BSA) ekleyin. Numuneleri 4 ° C'de gece boyunca (% 1 BSA ile desteklenmiş PBS'de 5 μg / ml) anti-βIII-tubulin için etiketleyin.
6. PBS'de% 1 BSA'da 0.4-2 μg / ml'lik bir konsantrasyon kullanarak uygun bir ikincil antikor (örneğin TRITC (Tetrametilrodamin) konjuge anti-fare IgG antikoru) ile hücreleri karanlıkta 90 dakika boyunca inkübe edin. Hücre çekirdeklerini DAPI (4 ", 6-diamidino-2-fenilindol) (deiyonize suda 0.1 μg / ml) ile 10 dakika boyunca etiketleyin.
   Not: Antikor konjugasyonu ve konsantrasyonu şirket protokolüne göre değişebilir. Her boyama aşamasından sonra numuneleri PBS ile 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
7. En az 20 × objektif kullanarak epifloresan veya konfokal mikroskopi ile görüntü örnekleri. İkincil antikora göre mikroskop filtrelerini seçin. Hücre çekirdeklerini görselleştirmek için bir DAPI filtresi (λEX = 358 nm; λEM = 488 nm) seçin.
8. Resimleri değerlendirerek analiz edin: i) maksimum nörit uzunluğu (nöritin ucundan hücre gövdesinin başlangıcına kadar olan uzunluğu kaydedin), ii) nöronal hücre başına nörit sayısı (hücre başına tüm nöritleri toplayın) ve iii) nöritli hücrelerin yüzdesi (βIII-tubulin eksprese eden toplam hücre sayısını, pozitif lekeli bir çekirdeğe sahip toplam hücre sayısına bölün)

Sonuçlar

Şekil 1. Optik fiber deney düzeneği (A) ve 0,4 mm2'ye (B) eşit alana sahip bir lazer ışını için lazer gücünün bir fonksiyonu olarak ortalama lazer ışınımları. Işın parametreleri (A): fiberden çıkan maksimum ışık konisinin yarım açısı (θ), ışın yarıçapı (r) ve optik fiber ile numune arasındaki mesafe (d).

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Au NR	Sigma Aldrich	716812
NG108-15	Sigma Aldrich	8811230
DMEM (Ömer Çiçeğ	Sigma Aldrich	D6546
Fcs	Yaşam Teknolojileri	10100147
L-glutamin	Sigma Aldrich	G7513
Penisilin / streptomisin	Yaşam Teknolojileri	15140122
Amfoterisin B	Yaşam Teknolojileri	15290018
Formaldehit	Sigma Aldrich	F8775 Serisi
Triton X-100	BDH (Türkçe)	T8532
Bsa	Sigma Aldrich	A2058
Anti-βIII-tübülin	Promega	G7121
TRITC konjuge anti-fare IgG antikoru	Sigma Aldrich	T5393 Serisi
DAPI (DAPI	Canlandırıcı	D1306
UV-Vis spektrometresi	Varian Tıbbi Sistemler A.Ş.	Cary 50 Biyografi
Mini santrifüj	Eppendorf Belediyesi	Mini Döndürme
Sonik banyo	Unisonics Avustralya	FPX 10D
Hücre kültürü inkübatörü	Kendro Belediyesi	Hera Hücre 150
Hücre kültürü santrifüjü	Hettich	Rotofix 32A
Lazer diyot	Optoteknik	780 nm tek modlu fiber bağlantılı LD
Optik fiber	Thorlab'lar	780 beygir gücü
Güç ölçer	yapışık	Lazer Kontrolü
ResimJ	http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
Epifloresan mikroskop	Akson Aletleri	ImageX-5000A'ya basın
Pbs
Polistiren 96 kuyulu plaka
CO2
T75 Şişeleri