1. Çözeltilerin hazırlanması
- E2 ortamı (1x)
- Tablo 1'de gösterilen tüm bileşenleri birleştirerek 100x E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) ve 500x E2C (100 mL) çözeltileri hazırlayın. Otoklav E2A, E2B ve E2C çözümleri. 4 °C'de saklayın.
- 1x E2 ortamı için: 5 mL 100x E2A, 1 mL 500x E2B ve 1 mL 500x E2C'yi birleştirin. Steril su ile hacmi 500 mL'ye getirin. PH'ı 7.0-7.5'e ayarlayın.
- 1x E2 ortamının 50 mL'lik alikotlarını hazırlayın ve uzun süreli saklama için -20 °C'de saklayın. Bununla birlikte, çözülme üzerine yağışlar meydana gelebilir. Stok çözeltisini kullanmadan önce çökeltinin tamamen çözüldüğünden emin olun.
Tablo 1: Zebra balığı hücre kültürü için 1x E2 ortamının bileşenleri.
| çözüm | parça | miktar | konsantrasyon |
| 100X E2A (500 mL) | | | |
| NaCl (Doğal) | 43,8 gr | 1500 milyon |
| Kartal | 1.88 gr | 50 milyon |
| MgSO4 | 6 gr | 100 milyon |
| KH2PO4 | 1.03 gr | 15 milyon |
| Na2HPO4 | 0.34 gr | 5 milyon |
| 500X E2B (100 mL) | | | |
| CaCl2 | 5.5 gr | 500 milyon |
| 500X E2C (100 mL) | | | |
| NaHCO3 | 3 gr | 350 milyon |
| 1X E2 (500 mL) | | | |
| 100X E2A | 5 mL | 1 katı |
| 500X E2B | 1 mL | 1 katı |
| 500X E2C | 1 mL | 1 katı |
- E3 Medya (1x)
- 1 x stok yapmak için bileşenleri Tablo 2'de gösterildiği gibi 1 L steril suda çözün. 1x E3 ortamı yapmak için stoğu steril suyla seyreltin.
- % 0.2 metilen mavisi ekleyin. 20 mL 1x E3 ortamı için 40 μL metilen mavisi ekleyin.
Tablo 2: Zebra balığı embriyolarını korumak için 100x E3 ortamının bileşenleri.
| parça | Miktar (g) | 100X stokta konsantrasyon (mM) |
| NaCl (Doğal) | 29,22 | 500 |
| Kartal | 1,26 | 17 |
| CaCl2 2H2O | 4,85 | 33 |
| MgSO4 7H2O | 8,13 | 33 |
- 80x tuzlu stok çözümü
- Tablo 3'te gösterilen tüm bileşenleri birleştirin. 100 mL çözelti yapmak için su ekleyin. Tüm bileşenler çözülene kadar karıştırın. Solüsyonu 4 °C'de saklayın.
Tablo 3: Zebra balığı hücre kültürü ortamı için 80x tuzlu su çözeltisinin bileşenleri.
| parça | Miktar (g) | Stoktaki konsantrasyon (mM) |
| glikoz | 1,44 | 80 |
| Sodyum Pirüvat | 0,44 | 40 |
| CaCl2 2H2O | 0,148 | 10 |
| HEPES ÜNİVERSİTESİ | 6.1 | 256 |
- Zebra balığı hücre kültürü ortamı (ZFCM+)
- 250 mL ortam elde etmek için Tablo 4'te gösterilen tüm bileşenleri birleştirin. PH'ı 7.5'e ayarlayın. Ortamı 0,22 μm filtre kullanarak filtreleyin ve 4 °C'de saklayın.
Tablo 4: Serum ve antibiyotikli zebra balığı hücre kültürü ortamının bileşenleri.
| parça | Miktar (mL) | Hacim % |
| L-15 orta (fenol kırmızısı ile) | 212,75 | 85,1 |
| Fetal Sığır Serumu (FBS) | 5 | 2 |
| Penisilin / Streptomisin | 1 | 0,4 |
| 80X Tuzlu su çözeltisi | 3.125 | 1,25 |
| Su | 28.125 | Saat 11.25 |
2. Zebra balığı embriyolarından elde edilen primer retinal ganglion hücre kültürü
NOT: Laminer akış başlığında 2.1 ve 2.2 adımlarını gerçekleştirin.
- Lamellerin hazırlanması
- Her deneyde 4-6 kültür plakası hazırlayın. % 100 etanolde saklanan asitle temizlenmiş lameller (22 x 22 mm kare; 0,16-0,19 mm kalınlık) kullanın.
- Forseps kullanarak saklama kabından bir lamel çıkarın ve kalan etanolü çıkarmak için alevlendirin.
- Lameli 35 mm'lik bir kültür kabının içine belirli bir açıyla yerleştirerek tamamen kurutun.
- 10x stoğu (5 mg / mL) steril suda seyrelterek Poli-D-Lizin (PDL) çalışma solüsyonunu (1x) hazırlayın.
- Her lamel ortasına 100 μL 0.5 mg / mL PDL uygulayın ve çözeltinin kenarlara yayılmasını önleyin.
- PDL'yi lameller üzerinde oda sıcaklığında (RT) 20-30 dakika inkübe edin. PDL'nin kurumadığından emin olun.
- PDL'yi 0,5 mL steril su ile üç kez yıkayın. Plakaların tamamen kurumasını bekleyin.
- 1x PBS'de 50x stoğu (1 mg / mL) seyrelterek laminin çalışma solüsyonu (1x) hazırlayın.
- PBS'de 100 μL 20 μg/mL laminini her lamel ortasına uygulayın ve çözeltinin kenarlara yayılmasını önleyin.
- Plakaları 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 2-6 saat inkübe edin. Laminin çözeltisinin kurumasını önleyin.
- Embriyo diseksiyonu ve platasyonu RGC'ler
- Dört adet 35 mm'lik doku kültürü kabı hazırlayın ve etiketleyin ve diseksiyon gününde 4 mL: %70 etanol, "E2 ortam 1", "E2 ortam 2", "E2 ortam 3" ile doldurun. Bulaşıkları diseksiyona kadar buzdolabında saklayın.
- Zebra balığı embriyoları döllenmeden 34 saat sonra (hpf) olduğunda, laminin ile kaplanmış kültür kaplarını inkübatörden çıkarın ve lamelleri 0,5 mL 1x PBS ile üç kez yıkayın.
- Son yıkamadan sonra, her kültür kabına 4 mL ZFCM (+) ortamı ekleyin ve plakayı kurutmaktan kaçının.
- Hazırlanan kültür kaplarını Adım 2.2.1'den alın. RT'ye dengelenmelerine izin verin.
- 4-6 PCR tüpünü 15 μL ZFCM (+) ortamla doldurun. 4 gözden RGC'leri bir lamel üzerine kaplanacak şekilde hazırlamak için bir tüpe ihtiyaç vardır.
- Zebra balığı embriyolarını inkübatörden alın ve embriyoları sterilize etmek için 5-10 saniye boyunca% 70 etanol içeren 35 mm'lik doku kültürü kabına daldırın.
- Bir transfer pipeti kullanarak, fazla etanolü yıkamak için embriyoları steril E2 ortamı içeren E2 Ortamı 1 kabına aktarın.
- Embriyoları E2 Media 2 kabına aktarın ve koryonlarını keskin forsepslerle çıkarın.
- Diseksiyon yapmak için embriyoları son E2 Media 3 kabına aktarın.
- Bir çift ince forseps kullanarak retinaları inceleyin.
- Embriyoları forsepslerden biri ile yumurta sarısının önüne yerleştirin ve tutun ve diğer forseps ile yumurta sarısı kesesinin arkasındaki kuyruğu çıkarın.
- Boynunuzu forseps ile tutun ve beyninizi ve gözlerinizi E2 ortamına maruz bırakmak için başınızı çıkarın. Yumurta sarısı kesesini kesmekten kaçının.
- İnce forsepslerin ucuyla, ikinci forseps ile kraniyal dokuyu aşağı doğru tutarken gözleri nazikçe kafadan yuvarlayın. Gözleri bitişik doku kalıntılarından izole edin.
- Dört gözü ZFCM (+) içeren önceden hazırlanmış tüplerden birine aktarın.
- Hücreleri ayırmak için P20 pipeti ve sarı bir uçla yaklaşık 45 kez nazikçe yukarı ve aşağı titre edin. Hava kabarcığından kaçının.
- Ayrışmış hücrelere sahip ZFCM(+) yi lamel merkezine aktarın. Ek lameller için 10-12 arasındaki adımları tekrarlayın.
- Titreşimleri emmek için kültürleri 22 °C'de tezgah üzerinde polistiren köpük raf üzerinde tutun.
- Kaplamadan 6-24 saat sonra görüntüleme yapın.
