Manyetik Platformlarda Manyetik Nano Parçacık Yüklü Nöronların Büyümesi ve Farklılaşması

Özet

Kaynak: Indech, G., et al. Birbirine Bağlı Nöronların Mikron Ölçekli Organizasyonu için Manyetik Platformların İmalatı. J. Vis. Exp. (2021).

Bu video, floresan manyetik nanopartiküllerin (MNP'ler) endositoz yoluyla nöronal hücreler tarafından alımını göstermektedir. Bu MNP yüklü nöronların manyetik olarak desenli substrat üzerinde büyütülmesi, hücrelerin bağlanmasını sağlar. Ortam içeren bir büyüme faktörünün eklenmesi, nöron uzantılarının büyümesine yardımcı olurken, substratın manyetik alanı, uzantının yönelimini yönlendirir.

Protokol

1. Hücresel manyetik nanoparçacık (MNP) alımı

1. Roswell Park Medical Institute (RPMI) ortamına% 10 at serumu (HS),% 5 fetal sığır serumu (FBS),% 1 L-glutamin,% 1 penisilin / streptomisin ve% 0.2 amfoterisin ekleyerek PC12 hücre kültürü için temel büyüme ortamını hazırlayın ve 0.22 μm naylon filtre kullanarak filtreleyin.
2. PC12 farklılaşma ortamını hazırlamak için RPMI ortamına %1 at serumu (HS), %1 L-glutamin, %1 penisilin / streptomisin ve %0,2 amfoterisin ekleyin ve 0,22 μm naylon filtre kullanarak süzün.
3. 10 mL bazik büyüme ortamı ile işlenmemiş bir kültür şişesinde hücreleri büyütün; her 2-3 günde bir şişeye 10 mL bazik büyüme ortamı ekleyin ve 8 gün sonra hücreleri alt kültürleyin.
4. Hücresel alım için, hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpünde 200 × g ve oda sıcaklığında 8 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
5. Hücreleri 3 mL taze bazik büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Yine, hücre süspansiyonunu 200 × g ve oda sıcaklığında 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücreleri 3 mL taze farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin.
6. Hücre kümelerini parçalamak için bir şırınga ve bir iğne kullanarak hücreleri 10x aspire edin. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve 10⁶ hücreyi normal kaplamasız 35 mm'lik bir tabakta tohumlayın.
7. İstenilen MNP konsantrasyonunu ve toplam hacmi elde etmek için hesaplanan MNP süspansiyon hacmini ve farklılaşma ortamının hacmini tabağa ekleyin. Hücreleri, MNP'leri ve farklılaşma ortamını karıştırın; Çanağı %5_CO2 nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de 24 saat inkübe edin.
8. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında 200 × g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücreleri 1 mL taze farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın.

2. Manyetik platformda hücre farklılaşması ve büyümesi

1. Desenli alt tabakayı %70 v/h/ etanol ile temizleyin ve alt tabakayı davlumbazdaki 35 mm'lik bir kültür kabına yerleştirin. Desenli alt tabakanın altına 1 dakika boyunca büyük bir mıknatıs (~ 1500 Oersted) yerleştirin ve önce çanağı mıknatıstan yukarı ve uzağa hareket ettirerek mıknatısı çıkarın ve ardından mıknatısı davlumbazdan çıkarın. Ultraviyole ışığı 15 dakika boyunca açın.
2. Kollajen tip 1'i (sıçan kuyruğundan elde edilen çözelti) 1:50% 30 v / v etanol içinde seyrelterek substratı kollajen tip 1 ile kaplayın. 35 mm'lik bir tabağı kaplamak için 1 mL %30 etanole 20 μL kollajen ekleyin.
3. Çanağı solüsyonla örtün ve tüm solüsyon buharlaşana kadar bekleyin ve tabağı birkaç saat açıkta bırakın. 3x'i steril 1x PBS'de yıkayın; Cam slayt, hücre tohumlama için hazırdır.
4. Hücresel MNP alımından sonra hücreleri askıya alın, 35 mm'lik bir kültür kabında 10⁵ hücreyi tohumlayın ve 2 mL farklılaşma ortamı ekleyin. Kültürü %5 CO2, 37 ° C'de nemlendirilmiş inkübatörde inkübe edin.
5. 24 saat sonra, 1:100 taze murin β-NGF (son konsantrasyon 50 ng / mL) ekleyin. Farklılaşma ortamını yenileyin ve her 2 günde bir taze murin β-NGF ekleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
6 oyuklu hücre kültürü plakası	doğan	353846
96 oyuklu hücre kültürü plakası	SPL yaşam bilimleri	30096
Amfoterisin B çözeltisi	Biyolojik Endüstriler	03-028-1B
Sığır serum albümini (BSA)	Biyolojik Endüstriler	03-010-1B
Hücre ve Doku kültür şişesi	Biyofil	TCF002250	75,0 cm^2 250 mL Havalandırma kapağı, İşlenmemiş
Hücre kültürü kabı	Greiner Bio-Bir	627-160	35 Milimetre
Santrifüj tüpü	Biyofil	CFT021500	50 mL
Kollajen tip I	Corning A.Ş.	354236	Sıçan Kuyruğu, konsantrasyon aralığı 3-4 mg / mL
Tek kullanımlık iğne	KDL (Türkçe)		23 gr
Tek kullanımlık şırınga	Medispo	1160227640	10 mL
Donör at serumu	Biyolojik Endüstriler	04-124-1A
Etanol %70	ROMİK LTD. ŞTİ.	19-009102-80
Etanol mutlak (Susuz)	Biyolab-kimyasallar	52505
Fetal sığır serumu (FBS)	Biyolojik Endüstriler	04-127-1A
Taze murin β-NGF	Peprotech teknolojisi	450-34
GMW C-çerçeve elektromıknatısı.	Buckley sistemleri LTD		3470, 45 mm
L-glutamin	Biyolojik Endüstriler	03-020-1B
PBS 10 kat	HyLabs (Türkçe	BP507/1LD
PC12 hücre hattı	ATCC (Uzay Servisi)	CRL-1721
Penisilin-streptomisin nistatin çözeltisi	Biyolojik Endüstriler	03-032-1B
L-glutamin ile RPMI 1640	Biyolojik Endüstriler	01-100-1A

Belediyesi ) Serisi