$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. İnsan embriyonik kök hücreleri (hESC) nitelikli Bazal Membran Matris Kaplı Plakaların Hazırlanması
- Jel oluşumunu önlemek için hESC onaylı bazal membran matrisi (Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisini en az 2-3 saat veya gece boyunca 4 °C'de yavaşça çözün.
- Bodrum membran matris kaplı plakaları hazırlamak için, matrisi soğuk Dulbecco'nun Modifiye Eagle Ortamında F12 (DMEM + F12) ile %2'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. İyice karıştırın ve 6 oyuklu bir plakanın her bir kuyusunu 1 mL seyreltilmiş matris çözeltisi ile kaplayın.
- Bodrum membran matris kaplı plakaları oda sıcaklığında (RT) en az 3 saat veya gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
not: Bazal membran matrisli plakalar, matris çözeltisi çıkarılmadan ve plakalar kullanılmadan önce 1 hafta boyunca 4 °C'de saklanabilir.
2. Koloni tipi hESC'lerin Tek hücreli hESC Kültürüne adaptasyonu
- Bazal membran matrisi üzerinde büyütülen koloni tipi H9 (WA09) hESC'lerin besleyici içermeyen kültürlerini geçmek için, ortamı kuyulardan aspire edin (Şekil 1A).
- 1x'i 1 mL DPBS ile yıkayın. Kuyucuk başına 1 mL dispas çözeltisi (1 U/mL) ekleyin ve 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
- Dispası çıkarın, hücreleri 1x 2 mL DMEM / F12 ile nazikçe yıkayın, ortamı çıkarın ve her plakaya 2 mL DMEM / F12 ekleyin.
- Nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyerek kolonileri nazikçe ayırın ve 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Peletleri 370 x g'da 2 dakika santrifüjleyin ve ortamı aspire edin.
- Hücre peletlerini tek hücrelere ayırmak için 2 mL hücre ayırma çözeltisi ekleyin (1x konsantrasyon, Malzeme Tablosuna bakınız) ve 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
- Hücreleri 370 x g'da 2 dakika santrifüjleyin ve ayırma solüsyonunu çıkarın.
- Taze mTeSR1 insan ESC ortamı ekleyin ve hücreleri yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyerek tek hücrelere ayırın.
- Koloni tipi hESC'leri tek hücreli tip bir kültüre uyarlamak için, 24 saat boyunca 10 μM ROCK inhibitörü içeren 2 mL mTeSR1 içinde bazal membran matris kaplı 6 oyuklu plakanın her bir oyuğuna yaklaşık 1.5–2.0 x10 6 hESC plaka uygulayın (Şekil 1A).
- 24 saat sonra, hESC ortamını ROCK inhibitörü içermeyen taze mTeSR1 ile değiştirin ve hESC'lerin 3 gün boyunca tek hücreli tip olarak büyümesine izin verin. Ortamı günlük olarak değiştirin.
- 4. günde, kültürler yaklaşık% 100 birleşmeye ulaştığında, hücreleri ayırma çözeltisinde ayırın, ardından adım 2.6.
'da açıklandığı gibi yeniden plakalayın
not: ROCK inhibitörü, tek hücreli tip hESC kültürünün ilk 24 saati boyunca hücre sağkalımını artırır.
3. Tek Hücreli Tip hESC'lerin NPC'lere Farklılaşması (Şekil 2)
- NPC farklılaşmasını indüklemek için, tek hücreli tip hESC'leri 1 mL ayırma çözeltisi (1x) ile ayırın ve 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
- Hücreleri 370 x g'da 2 dakika santrifüjleyin ve ayırma çözeltisi süpernatantını çıkarın. 1 mL DMEM/F12 ekleyin ve nazik pipetleme ile hücreleri yeniden süspanse edin.
- 10 μM ROCK inhibitörü içeren 2 mL mTeSR1 içinde 2 x 105 hücre/kuyu yoğunluğunda bazal membran matris kaplı 6 oyuklu plaka üzerindeki plaka hücreleri.
- 24 saat sonra, kültür ortamını 1 μM dorsomorfin ve 5 μM SB431542 ile takviye edilmiş bir nöral indüksiyon ortamı (% 1 B27 eksi A vitamini içeren DMEM) ile değiştirin.
- Nöral indüksiyonun ilk 4 günü boyunca ortamı her gün, daha sonra 7. günde birleşmeye ulaşana kadar her gün değiştirin (Şekil 2B).
NOT: (1) Dorsomorfin, ALK2,3,6 reseptörlerini hedefleyerek BMP yolunu inhibe eder ve ayrıca AMPK'yi inhibe eder; SB431542, ALK5,7'yi hedefleyerek TGFβ/Aktivin yolunun bir inhibitörüdür. (2) Aynı protokol, WA09 ile benzer sonuçlar veren başka bir ESC hattı (WA01) ile test edildi. (3) Bodrum membran matrisi için genellikle Matrigel kullandık; bununla birlikte, hücreler Geltrex üzerinde kültürlenebilir ve daha sonra birkaç NPC markörünün ekspresyonu ile gösterildiği gibi çok benzer sonuçlarla NPC'lere farklılaştırılabilir (Şekil 3D, E). Geltrex'i Matrigel ile aynı şekilde kullanın (bkz. bölüm 1).
