Yetişkin Bir İnsan Beyninden Serbest Yüzen Dilim Kültürlerinin Hazırlanması

Özet

Kaynak: Fernandes, A., et al. Yetişkin İnsan Beyninden Kısa Süreli Serbest Yüzen Dilim Kültürleri. J. Vis. Exp. (2019).

Bu video, yetişkin insan beyninden serbest yüzen dilim kültürleri hazırlamak için bir tekniği göstermektedir. Bir vibratom kullanılarak bir beyin bölümünden ince dilimler oluşturulur. Bu dilimler daha sonra doku canlılığını korumak için büyüme faktörleri ile desteklenmiş bir kültür ortamında süspanse edilir.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Malzemelerin sterilizasyonu

NOT: Tüm malzeme ve solüsyonlar kullanımdan önce sterilize edilmelidir.

1. Tüm cerrahi aletleri ve vibratom dilimleme malzemelerini (bıçak tutucu, numune diski, tampon tepsisi) 180 °C'de 4 saat kuru bir sterilizasyon fırınında sterilize edin.
2. Sıcaklığa duyarlı malzeme veya ekipmanı UV veya gama ışınlaması ile sterilize edin.
3. Ortamı ve çözeltileri 0,22 μm gözenek zarlarından otoklavasyon veya filtreleme yoluyla sterilize edin.

2. Çözeltilerin hazırlanması

1. 15-20 mL taşıma çözeltisi hazırlayın:% 50 v / v Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) pH 7.4,% 50 v / v doğum sonrası ve yetişkin beyin nöronlarının bakımı için bazal ortam (Malzeme Tablosu), 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES), 3 mg / mL glikoz ve 33 μg / mL gentamisin.
   not: Taşıma çözeltisi, numune alınmadan önce en az 20 dakika süreyle soğutulmalı ve oksijenlendirilmelidir (karbojen gazı ile köpürtülmelidir).
2. 300 mL dilimleme çözeltisi hazırlayın (10 mM HEPES ve 3 mg / mL glikoz ile desteklenmiş HBSS) ve bir dondurucuda ilk kristal oluşum noktasına kadar soğutun.
3. 20 mL kültür ortamı hazırlayın: doğum sonrası ve yetişkin beyin nöronlarının bakımı için bazal ortam (Materyal Tablosu)% 1 L-glutamin türevi (Malzeme Tablosu), nöral kültür için% 2 takviye (Malzeme Tablosu),% 1 penisilin / streptomisin ve 0.25 μg / mL amfoterisin B.

>3. Dilimleme aparatının kurulması

>NOT: Bu protokol, cerrahi odada numune toplama lojistiği nedeniyle ideal olarak bir meslektaşın yardımıyla gerçekleştirilir.

1. Tuz eklenmiş bir kova buzda, dilimleme solüsyonunu kullanmadan önce en az 20 dakika boyunca karbojen karışımı köpürmesi (%95 O₂,% 5 CO₂) altında dinlendirin.
2. %3'lük bir agaroz bloğu (yaklaşık 2 cm x 2 cm x 2 cm) hazırlayın ve dilimleme sırasında doku örneğine ek mekanik destek oluşturmak için vibratom örnek diskine süper yapıştırın (Şekil 1E).
3. Dilimleme için titreşimi ayarlayın: kesit kalınlığı 200 μm, titreşim frekansı 100 Hz ve dilimleme hızı 0,5-1,0 mm/sn arasında.
4. Vibratom tampon tepsisini vibratom tabanına kilitleyin ve dilimleme solüsyonunu ve numuneyi almadan önce ve dilimleme prosedürü boyunca buzdolabında tutmak için buz ekleyin.

4. Örnek toplama

>NOT: Bu protokolde insan neokortikal dokusu ameliyathanede toplandı ve laboratuvara taşındı.

DİKKAT: İnsan numuneleri ile çalışırken, Kurum tarafından belirlenen uygun güvenlik protokollerini izleyin.

1. Aşağıdakilerden oluşan taşıma aparatını (Şekil 1C) kurun: gaz çıkışını taşıma kabına bağlayan bir silikon boruya bağlı gaz çıkışını kontrol eden bir basınç/akı valfine bağlı karbojen karışımlı portatif bir gaz silindiri; gaz girişi için delikli kapaklı, genellikle 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpü olan bir taşıma kabı, taşıma çözümünü içeren; ve taşıma sırasında numunenin soğutulması için buz.
2. Numuneyi toplayın ve hemen laboratuvara taşıyın (Şekil 1B). Numuneyi soğuk taşıma çözeltisine daldırın (sürekli olarak karbojen karışımı ile köpürtülür).

5. Dilimleme

1. Numuneyi dilimleme solüsyonu içeren bir Petri kabına (100 mm x 20 mm) aktarın ve ince cerrahi aletlerle numunede kalan meninksleri mümkün olduğunca dikkatlice çıkarın (Şekil 1D).
2. Deney tasarımının belirli özelliklerine sahip dilimler üretmek için en iyi numune oryantasyonunu seçin ve 24 numaralı neşter bıçağıyla, numune diskine yapıştırılmış taban olacak şekilde düz bir yüzeyi düzeltin.
3. Tek kullanımlık bir plastik kaşık ve hassas boya fırçaları kullanarak, parçayı Petri kabından toplayın ve fazla çözeltiyi filtre kağıdı kullanarak kurutun (kılcallık ile kurutun ve doku parçasına kağıtla dokunmaktan kaçının).
4. Süper yapıştırıcı kullanarak, dokuyu diske sıkıca yapışana ve agaroz bloğu ile temas edene kadar vibratom numune diskine tutturun (Şekil 1E).
5. Vibratom numune diskini (doku uygun şekilde takılmış olarak), tüm süreç boyunca köpürmesi gereken dilimleme solüsyonu ile doldurulmuş vibratom tampon tepsisine yerleştirin.
6. Tıraş bıçağı sıkıca sabitlenmiş halde bıçak tutucuyu yerine kilitleyin.
7. Dilimleme çözeltisi hem numuneyi hem de bıçağı kapsamalıdır, ancak bundan sonra dilimlemeye başlamalıdır (Şekil 1F).
8. Numuneyi 200 μm'lik dilimler halinde kesin.
   not: Bazı vibratomlar numuneleri otomatik olarak kesse de, işlem sırasında yakın gözlem ve dilimleme hızındaki küçük ayarlamalar daha iyi dilimler üretilmesine yardımcı olabilir. İlk düzensiz dilimleri atın.
9. Dilimleri tampon tepsisinden dilimleme solüsyonu içeren bir Petri kabına aktarın ve gevşek kenarları ve fazla beyaz materyali yaklaşık %70 korteks/%30 beyaz madde oranına kadar kesin.

6. Kültür

NOT: Bu adımı steril ortamda laminer akış kabininde gerçekleştirin.

1. Oyuk başına 600 μL kültür ortamı ekleyin (24 oyuklu bir plakada) ve dilimleri kaplamadan önce 36 ° C ve% 5 CO_2'de en az 20 dakika inkübe edin.
2. Bir boya fırçası kullanarak oyuk başına bir dilim tabaklayın (Şekil 1G).
3. Plakada kullanılmayan kuyular varsa, bunları 400 μL steril su ile doldurun.
4. Plakayı 36 °C, %5 CO₂.
   'de inkübe edin not: İlk orta boy değişimi, dilimin boyutuna bağlı olarak kaplamadan sonra 8-16 saat arasında yapılmalıdır.
5. Önceden hazırlanmış kültür ortamının 10 mL'sini 50 ng/mL beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF) ile takviye edin.
   not: İlk 8-16 saat boyunca, besin yoksunluğunu ve asitleşmeyi önlemek için dilimler 600 μL ortamda inkübe edilir, çünkü bu aşamada ortam tüketimi hızlanır. Bir sonraki adımdan itibaren, oyuk başına ortam hacmi 400 μL'ye ayarlanır.
6. Her bir oyuktan 333 μL şartlandırılmış ortamı çıkarın ve 133 μL taze BDNF takviyeli ortam ekleyin.
7. Şartlandırılmış ortamın üçte birini taze BDNF takviyeli ortamla değiştirerek her 24 saatte bir ortam değiştirme işlemini tekrarlayın.

Sonuçlar

Şekil 1: Yetişkin insanlardan kortikal dokunun örnek alınması, taşınması, dilimlenmesi ve kültürlenmesi. İlaç dirençli epilepsi (A,B) tedavisi için temporal lobektomiden kortikal doku toplanması ile işlem ameliyathanede başlar. (C) Doku parçası (n = 1) hemen buz gibi soğuk oksijenli taşıma ortamı içeren bir tüpe aktarılır (aşağıya bakınız). (D) Laboratuvarda, meninksler ince oftalmik cımbız kullanılar...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
agaroz	Sigma Aldrich	A9539
Amonyum persülfat	Sigma	A3678-25G
Amfoterisin B	Gibco (Gibco)	15290-018
B27	Gibco (Gibco)	17504-044
BDNF (BDNF)	Sigma Aldrich	SRP3014
Sığır Serumu Albümini	Sigma Aldrich	A7906
glikoz	Merck	108337
Glutamax (Glutamaks)	Gibco (Gibco)	35050-061
Hank'in Dengeli Tuzları	Sigma Aldrich	H1387-10X1L
Hepes Belediyesi	Sigma Aldrich	H4034
Nörobazal A	Gibco (Gibco)	10888-022
PBS Tampon pH 7.2	Laborclin	590338
Penisilin / Streptomisin	Sigma Aldrich	P4333 Serisi
Ekipman ve Malzeme
Karbojen Karışımı	Beyaz Martinler		%95 O2, %5 CO2
CO2 kuluçka makinesi	New Brunswick Bilimsel	CO-24 Tezli Yüksek Ko-24	Dilimlerin inkübasyonu% 5 CO2, 36ºC
Plastik kaşık			Bir tatlı kaşığı büyüklüğü
Tıraş bıçağı	Bic (İngilizce)		Krom Platin, vibratom ile dilimlemede kullanılır
Neşter Bıçağı	Becton Dickinson (BD)	24 numara	Doku dilimlemek için kullanılır; aynı boyutta veya daha küçük önerilir
Süper Yapıştırıcı (Loctite Super Bonder)	Henkel Tekstil		Kompozisyon: Etilcianoacrilato; 2-Propenoik asit; 6,6'-di-terc-butil-2,2'-metilenodi-p-kresol; homopolimer
Vibratom	Leica Belediyesi	14047235612 - VT1000S

· Serisi Sertifikası · · Serisi · · Serisi ·