Sıçan Beyinlerinden Serumsuz Besiyeri Kullanılarak Mikroglia İzolasyonu ve Kültürü

Özet

Kaynak: Collins, H. Y., et al., Serumsuz Ortamda Dinamik Dallanmış Morfolojiyi Teşvik Etmek için Kemirgen Mikrogliasının İzolasyonu ve Kültürü. J. Vis. Uzm. (2018)

Bu video, sıçan beyinlerinden mikroglia'yı izole etmek ve kültürlemek için bir yöntemi göstermektedir. Mikrogliaya özgü bir monoklonal antikor ile kaplanmış plakalar kullanılarak mikroglia'yı diğer nöronal ve nöronal olmayan hücrelerden ayırmayı gerektirir.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. CD11b İmmünopanning için Bir Petri Kabı Hazırlayın (Gün 0)

NOT: Her 1-2 yavru sıçan beyni için 1 immünopanning kabı hazırlayın.

1. 15 cm'lik bir Petri kabına 25 mL 50 mM Tris pH 9.5 çözeltisi ekleyin.
2. 6 μg/mL'lik bir son konsantrasyon için yemeğe keçi önleyici fare IgG (H + L zincirleri) ekleyin. Eşit dağıtmak için girdap plakası.
3. Çanağı 37 °C'de 1-3 saat inkübe edin.
4. Bulaşıkları DPBS++ (Ca²⁺ ve Mg²⁺ ile fosfat tamponlu salin (PBS)) ile üç kez durulayın, ardından 1 μg/mL OX42 antikoru içeren bir kaydırma tamponu çözeltisi ile değiştirin. Bulaşıkları gece boyunca oda sıcaklığında düz bir yüzeyde bırakın.

>2. Doku Toplama (1. Gün)

NOT: Bu protokol ~3 - 4 saat sürmelidir.

1. Başlamadan önce, tüm solüsyonların steril olduğundan ve buz üzerinde soğutulduğundan emin olun. Tüm aletleri buz üzerinde soğutun ve kullanmadan önce etanol ile sterilize edin.
2. Uygun düzenleyici prosedürleri izleyerek, genç bir laboratuvar faresini karbondioksit boğulması ile kurban edin.
   not: Alternatif olarak, genç hayvanlar öldürücü dozda ketamin / ksilazin (100 - 200 μL 24 mg / mL ketamin, 2.4 mg / mL ksilazin) ile feda edilebilir. Hayvanlar 14 günlükten küçükse ketamin / ksilazin kullanılmalıdır. Birden fazla hayvan kullanıyorsanız, dokuyu bir hayvandan çıkarın ve sonraki hayvanlara geçmeden önce buz üzerinde önceden soğutulmuş DPBS⁺⁺'a yerleştirin.
3. Devam etmeden önce bir arka pençeyi sıkıştırın ve hayvanın tamamen tepkisiz kaldığından emin olun.
4. Tampon berraklaşana kadar 271/2-G'lik bir iğne kullanarak hayvanı 10 - 30 mL buz gibi soğuk perfüzyon tamponu ile transkardiyal olarak perfüze edin.
   not: Perfüzyon tamponunun hacmi, hayvanın büyüklüğüne / yaşına bağlı olarak değişecektir.
5. Perfüzyondan hemen sonra hayvanın başını çıkarın. Omurilikten içeri girerken oksipital kondili diseksiyon makası ile her iki taraftan kesin, beyne zarar vermemeye dikkat edin. Her iki tarafı dikkatlice kestikten sonra, parietal ve frontal kemik boyunca bir tarafı burun kemiğine doğru kesin. Forseps ile kafatasının üst kısmını dikkatlice geri çekin, beyni (veya ilgilenilen CNS yapılarını) hızla çıkarın ve buz üzerinde önceden soğutulmuş DPBS ⁺⁺ içine yerleştirin.
6. Kalan tüm hayvanlar için tekrarlayın.
   not: Tüm işlem adımları, uygun steril koşullar altında laminer bir akış başlığında gerçekleştirilmelidir.

3. Mekanik Ayrışma (1. Gün)

1. Tüm beyinler toplandıktan sonra, bir beyni soğuk bir neşter bıçağı ile buz üzerinde bir Petri kabında 1 mm³ parçaya doğrayın ve 5 - 7 mL buz gibi soğuk douncing tamponu ile buz gibi soğuk bir dounce homojenizatöre aktarın. Her seferinde bir beyni ayırın.
2. Gevşek oturan bir dounce homojenizatör ile 10 - 20 yumuşak ve eksik vuruş kullanarak dokuyu ayırın. Homojenizatörün altındaki dokuyu doğrudan ezmemeye dikkat edin, bunun yerine dokuyu pistonun kenarları ile homojenizatörün kenarları arasındaki boşluktan itin
.
3. Hava kabarcıklarının girmesini önlemek için pistonu dikkatlice çıkarın. Kötü ayrışmış doku parçalarının homojenizatörün dibine çökmesine izin verin ve süpernatanı yeni bir soğutulmuş 50 mL konik tüpe aktarın.
4. Çıkarılan hacmi yeni douncing tamponu ile değiştirin ve 3.2 ve 3.3 adımlarını toplam 3 - 4 tur boyunca veya tüm doku ayrışana kadar tekrarlayın. Her beyin için prosedürü tekrarlayın.

>4. Miyelin Kaldırma (1. Gün)

NOT: Miyelin giderimi, P12'den daha yaşlı hayvanlardan mikroglia izolasyonu için kullanılır.

1. 25 mL'lik bir pipet kullanarak 50 mL'lik konik tüpteki hücre süspansiyonunun hacmini ölçün, ardından toplam hacmi 33,5 mL'ye ayarlamak için buz gibi soğuk douncing tamponu ekleyin.
2. Hücre süspansiyonuna 10 mL miyelin ayırma tamponu (MSB) ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirerek iyice karıştırın. Bu, 43.5 mL'lik bir hacimde% 23'lük bir nihai MSB konsantrasyonu ile sonuçlanacaktır.
3. Hücreleri yavaş frenleme ile 4 °C'de 500 x g'da 15 dakika santrifüjleyin.
   not: Santrifüjün yavaşlaması yaklaşık 1,5 - 2 dakika sürmelidir. Bu, bir üst miyelin tabakası ve ölü hücre kalıntısı, biraz bulanık bir süpernatant ve canlı hücreler için zenginleştirilmiş daha küçük bir pelet üretecektir.
4. Miyelin/kalıntının üst tabakasını ve süpernatanı bir pipetle çıkarın. Mümkün olduğunca fazlasının çıkarıldığından emin olmak için üst tabakayı çıkarırken dikkatli olun.
5. Hücre peletini 12 mL kaydırma tamponunda yeniden süspanse edin. Kalabilecek hücre kümelerini parçalamak için hücre süspansiyonunu nazikçe ezin.

>5. İmmünopanning (1. Gün)

1. Büyük kalıntıları veya hücre kümelerini temizlemek için hücre süspansiyonunu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin.
2. OX42 kaplı kaydırma kabını DPBS++ ile üç kez durulayın. Yıkamalar arasında plakanın tamamen kurumasına izin vermeyin.
3. Son DPBS++ yıkamasını dökün ve filtrelenmiş hücre süspansiyonunu kaydırma kabına uygulayın. Hücreleri dağıtmak için plakayı hafifçe döndürün, ardından hücrelerin yapışmasını sağlamak için plakayı oda sıcaklığında düz bir yüzeyde 20 dakika inkübe edin. 20 dakikadan daha uzun süre kuluçkaya yatırmayın, aksi takdirde hücrelerin tabaktan kurtarılması çok zor hale gelir.
4. Yapışmayan hücreleri çıkarmak için kaydırma kabını DPBS++ ile 10 kez durulayın. Mikroglia plakaya sıkıca tutturulacaktır, bu nedenle diğer yapışmayan hücrelerin çıkarılmasını sağlamak için plakayı her durulamada
döndürün.
5. Son DPBS⁺⁺ yıkamasını dökün ve 15 mL DPBS++ ve 200 μL tripsin (%1,25 stok solüsyonu) ile değiştirin.
6. Tripsifikasyon için çanağı 37 ° C'de% 10 CO₂ ile ≤10 dakika inkübe edin.
   not: 10 dakikadan daha uzun süre devam etmeyin, aksi takdirde mikroglia'nın çıkarılması zorlaşır.
7. 10 dakikalık tripsinizasyondan sonra, mikroglia hala plakaya yapışacaktır. Tripsin / DPBS⁺⁺ 'ı dökün ve tripsini çıkarmak için 2 kez DPBS⁺⁺ ile nazikçe yıkayın, 12 mL buz gibi soğuk mikroglia büyüme ortamı (MGM) ile değiştirin.
8. Hücre/substrat etkileşimini zayıflatmaya yardımcı olmak için kaydırma kabını 2 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin ve kaydırma kabının alanlarının kurumasını önlemek için tepsinin düz olduğundan emin olun.
9. Kaydırma kabından hücreleri kurtarmak için 10 mL'lik bir pipet ve pipet kontrol cihazıyla yüksek hızda kuvvetlice pipetleyin. Tüm hücreleri çıkarmaya çalışmak için pipetten gelen sıvı akışıyla 16 x 16'lık bir ızgara çizin.
10. Hücrelerin plakadan ayrıldığından emin olmak için hücreleri 20X büyütmede mikroskop altında kontrol edin. Tabağın üst kısmında hücrelerin hala sıkışmış olduğu noktaları işaretleyin ve bu alanlarda pipetlemeyi tekrarlayın.
11. Hücre süspansiyonu toplayın ve 15 mL konik tüp başına 3-4 mL süpernatan alikot edin. Yavaş frenleme ile 4 °C'de 500 x g'de 15 dakika döndürün.
    not: Mikroglia'yı küçük bir hacimde döndürmek, hücrelerin maksimum geri kazanılmasını sağlar.
12. Süpernatanı aspire edin ve hücre peleti ile 0.5 mL MGM bırakın.
13. Her peleti kalan MGM'de yeniden süspanse edin ve hücreleri tüm tüplerden toplayın.
14. Hemositometre ile hücreleri sayın.
15. Uygulamaya bağlı olarak Adım 6 - 7'de açıklandığı gibi plaka hücreleri.
16. 37 °C'de %10 CO₂.
    ile kültür hücreleri not: Hücreler, düzenli ortam değişiklikleri ile 3-4 haftaya kadar veya ortam değişikliği olmadan bir hafta boyunca kültüre tabi tutulabilir.

>6. Spot Kaplama Doku Kültürü Plakaları/Lameller (1. Gün)

1. Plaka: 15 μL kollajen IV kaplama, doğrudan 24 oyuklu anyonik / katyonik kaplı doku kültürü plakasının merkezinde (ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız) ve 37 ° C'de% 10 CO₂ ile 15 dakika inkübe edin.
2. Hemositometre ile hücreleri saydıktan sonra, hücreleri MGM'de 2.3 x 10⁵ / mL'ye seyreltin. Kollajen IV noktasını aspire edin ve hemen bu noktaya 15 μL hücre süspansiyonu koyun; Bu, 3.5 x 10³ hücre / nokta verecektir. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için% 10 CO₂ ile 37 ° C'de 5 - 10 dakika inkübe edin, 500 μL CO₂ dengeli TGF-β2 / IL-34 / kolesterol içeren büyüme ortamı (TIC) yavaşça kuyuya ekleyin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Douncing Tamponu			Tarif: 50 mL DPBS++ içinde 200 μL %0.4 DNaseI Yorumlar: Buz gibi soğukken kullanın
Kaydırma Tamponu			Tarif: DPBS++ 'daki süt katılarından 2 mg / mL pepton
Mikroglia Büyüme Ortamı (MGM)			Tarif: 100 ünite/mL penisilin, 100 μg/mL streptomisin, 2 mM glutamin, 5 μg/mL N-asetil sistein, 5 μg/mL insülin, 100 μg/mL apo-transferrin ve 100 ng/mL sodyum selenit içeren DMEM/F12 Yorumlar: Mikroglia'yı immnopanning kabından çıkarmak için buz gibi MGM kullanın.
Kollajen IV Kaplama			Tarif: 2 μg/mL kollajen IV içeren MGM
Miyelin Ayırma Tamponu			Tarif: 9 mL Percoll PLUS, Ca++ ve Mg++ olmadan 1 mL 10x PBS, 9 μL 1 M CaCl2, 5 μL 1 M MgCl2 Yorumlar: CaCl2 ve MgCl2 ilavesinden sonra iyice karıştırın
Tripsin	Sigma	T9935
DMEM/F12	Gibco (Gibco)	21041-02
Penisilin / Streptomisin	Gibco (Gibco)	15140-122
DMEM (yüksek glikoz)	Gibco (Gibco)	11960-044
Kollajen IV			Sulandırma: PBS 'de 200 μg/mL Kullanılan konsantrasyon: 1:100 Depolama: -80°C
fare sıçan önleyici CD11b monoklonal (klon OX42)	Biyo-Rad	MCA275R	Kaydırma: 1:1.000; Boyama: 1:500
TGF-b2/IL-34/Kolesterol içeren büyüme ortamı (TIC)			Tarif: İnsan 2 ng/mL TGF-b2, 100 ng/mL murin IL-34, 1,5 μg/mL küçükbaş yünü kolesterol, 10 μg/mL heparan sülfat, 0,1 μg/ml oleik asit ve 0,001 μg/ml gondoik asit içeren MGM Yorumlar: 37 °C'ye ısıtılmış ortamlara kolesterol eklediğinizden emin olun ve 1,5 μg/mL'den fazla eklemeyin, aksi takdirde çökelir. Kolesterol içeren ortamları filtrelemeyin. Optimal pH'ı sağlamak için hücrelere eklemeden önce TIC ortamını 30 dakika - 1 saat boyunca% 10 CO2 ile dengeleyin.
Percoll ARTI	GE Sağlık	Kedi # 17-5445-02
Primeria Tabakları	VWR (VWR)	Kedi # 62406-456
DNaseI	Worthington	Kedi# DPRFS

Serisi Serisi