1. Beyin Diseksiyonu ve Dilimleme
- Hayvanın kafasını kes. Kafadaki cildi açmak ve kafatası kapağını ortaya çıkarmak için bir neşter kullanın.
- Kafatası kapağının üzerindeki deriyi kesmek için ince süper kesilmiş makas kullanın ve kafatasının kaudal / ventral tabanında her iki tarafta yanal olarak küçük kesiler yapın. Kafatasının kaudal / dorsal yönünden başlayarak, altta yatan beyne zarar vermemeye dikkat ederek dorsal orta hatta rostral yönde hareket ederek ek sığ kesimler yapın. Koku soğanı seviyesinde orta hatta dik olarak son bir 'T' kesimi yapın.
not: İlgilenilen beyin bölgelerine herhangi bir zarar verilmemesini sağlamak için özen gösterilmelidir. Özellikle, hiçbir zaman beynin kendisine herhangi bir sıkıştırma kuvveti uygulanmamalıdır.
- Kafatasını kavramak için yuvarlak uçlu forsepsleri kullanın, rostral-medial yönden başlayın ve kaudal-lateral yöne doğru geri soyun. Beyni açığa çıkarmak için her iki tarafın da çatlaması ve kafatası kapağının dorsal yarısını çıkarması için tekrarlayın. Sağlam beyni, önceden soğutulmuş NMDG-HEPES aCSF'nin kabına nazikçe çıkarın. Beynin ~ 1 dakika boyunca eşit şekilde soğumasına izin verin.
- Beyni beherden çıkarmak ve filtre kağıdı ile kaplı Petri kabının üzerine kaldırmak için büyük spatulayı kullanın. Beyni, tercih edilen dilimleme açısına ve istenen beyin ilgi alanına göre kesin ve bloke edin. Kullanım sırasında uzun süreli oksijen yoksunluğunu önlemek için hızlı çalışın.
not: Birçok dilimleme açısı mümkündür. Kesin engelleme yöntemi ve dilimleme açısı, tam beyin bölgesine, hücre tipine ve çalışılacak devreye bağlı olacaktır.
- Beyin bloğunu yapışkan yapıştırıcı kullanarak numune tutucuya yapıştırın. Numune tutucunun iç parçasını, beyin bloğunu tamamen içeri çekecek kadar geri çekin. Erimiş agarozu, beyin bloğu tamamen agarozla kaplanana kadar doğrudan tutucuya dökün. Önceden soğutulmuş aksesuar soğutma bloğunu, agaroz katılaşana kadar ~10 s boyunca numune tutucunun etrafına sıkıştırın.
- Numune tutucuyu dilimleme makinesindeki yuvaya yerleştirin ve doğru hizalamayı doğrulayın. Rezervuarı 250 mL'lik beherden kalan önceden soğutulmuş, oksijenli NMDG-HEPES aCSF ile doldurun ve yeterli oksijenasyonu sağlamak için dilimleme süresi boyunca bir kabarcık taşını rezervuara taşıyın.
- Agaroz gömülü beyin örneğini ilerletmeye başlamak için mikrometreyi ayarlayın. Dilimleyiciyi başlatın ve ilerleme hızını ve salınım frekansını ampirik olarak istenen seviyeye ayarlayın.
not: Her iki ayar da düşük aralıkta olmalıdır. En iyi sonuçlar için, bıçak kolunun tek bir geçişi yaklaşık 20 saniye sürmeli ve salınım, açık bir uğultu olmadan çok yumuşak ve hafif bir uğultu sesi üretmelidir.
- İlgilenilen beyin bölgesi tamamen kesilene kadar dokuyu 300 μm'lik artışlarla (veya tercih edilen başka bir kalınlıkta) ilerletmeye ve dilimlemeye devam edin; dilimleme işlemi için toplam süre 15 dakikadan az olmalıdır.
2. Optimize Edilmiş NMDG Koruyucu Kurtarma Prosedürü
- İlk NMDG geri kazanım adımı (kritik adım): Kesit alma prosedürünün tamamlanmasının ardından, kesilmiş plastik bir Pasteur pipeti kullanarak tüm dilimleri toplayın ve bunları 150 mL NMDG-HEPES aCSF ile doldurulmuş önceden ısıtılmış (34 °C) bir ilk geri kazanım odasına aktarın. Tüm dilimleri kısa bir süre içinde art arda aktarın ve tüm dilimler geri kazanım odasına taşınır taşınmaz bir zamanlayıcı başlatın.