Yöntem makalesi

NMDG Tabanlı Koruyucu Kurtarma Yöntemi Kullanılarak Beyin Bölümlerinin Hazırlanması

8 Temmuz 2025

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kaynak: Ting, J. T. et al. Optimize Edilmiş N-Metil-D-glukamin Koruyucu Kurtarma Yöntemi Kullanılarak Akut Beyin Dilimlerinin Hazırlanması. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu videoda, N-Metil-D-glukamin (NMDG) bazlı koruyucu kurtarma yöntemi kullanarak beyin dilimleri elde etmek için bir protokol açıklanmaktadır. Diseke edilmiş bir beyin, kesit sırasında nöronal hücre ölümünü ve hasarını en aza indirmek için NMDG ve HEPES ile bir aCSF'de inkübe edilir. Hücresel aktiviteleri eski haline getirmek için bölümün aCSF'de iyileşmesine izin verilir

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Beyin Diseksiyonu ve Dilimleme

  1. Hayvanın kafasını kes. Kafadaki cildi açmak ve kafatası kapağını ortaya çıkarmak için bir neşter kullanın.
  2. Kafatası kapağının üzerindeki deriyi kesmek için ince süper kesilmiş makas kullanın ve kafatasının kaudal / ventral tabanında her iki tarafta yanal olarak küçük kesiler yapın. Kafatasının kaudal / dorsal yönünden başlayarak, altta yatan beyne zarar vermemeye dikkat ederek dorsal orta hatta rostral yönde hareket ederek ek sığ kesimler yapın. Koku soğanı seviyesinde orta hatta dik olarak son bir 'T' kesimi yapın.
    not: İlgilenilen beyin bölgelerine herhangi bir zarar verilmemesini sağlamak için özen gösterilmelidir. Özellikle, hiçbir zaman beynin kendisine herhangi bir sıkıştırma kuvveti uygulanmamalıdır.
  3. Kafatasını kavramak için yuvarlak uçlu forsepsleri kullanın, rostral-medial yönden başlayın ve kaudal-lateral yöne doğru geri soyun. Beyni açığa çıkarmak için her iki tarafın da çatlaması ve kafatası kapağının dorsal yarısını çıkarması için tekrarlayın. Sağlam beyni, önceden soğutulmuş NMDG-HEPES aCSF'nin kabına nazikçe çıkarın. Beynin ~ 1 dakika boyunca eşit şekilde soğumasına izin verin.
  4. Beyni beherden çıkarmak ve filtre kağıdı ile kaplı Petri kabının üzerine kaldırmak için büyük spatulayı kullanın. Beyni, tercih edilen dilimleme açısına ve istenen beyin ilgi alanına göre kesin ve bloke edin. Kullanım sırasında uzun süreli oksijen yoksunluğunu önlemek için hızlı çalışın.
    not: Birçok dilimleme açısı mümkündür. Kesin engelleme yöntemi ve dilimleme açısı, tam beyin bölgesine, hücre tipine ve çalışılacak devreye bağlı olacaktır.
  5. Beyin bloğunu yapışkan yapıştırıcı kullanarak numune tutucuya yapıştırın. Numune tutucunun iç parçasını, beyin bloğunu tamamen içeri çekecek kadar geri çekin. Erimiş agarozu, beyin bloğu tamamen agarozla kaplanana kadar doğrudan tutucuya dökün. Önceden soğutulmuş aksesuar soğutma bloğunu, agaroz katılaşana kadar ~10 s boyunca numune tutucunun etrafına sıkıştırın.
  6. Numune tutucuyu dilimleme makinesindeki yuvaya yerleştirin ve doğru hizalamayı doğrulayın. Rezervuarı 250 mL'lik beherden kalan önceden soğutulmuş, oksijenli NMDG-HEPES aCSF ile doldurun ve yeterli oksijenasyonu sağlamak için dilimleme süresi boyunca bir kabarcık taşını rezervuara taşıyın.
  7. Agaroz gömülü beyin örneğini ilerletmeye başlamak için mikrometreyi ayarlayın. Dilimleyiciyi başlatın ve ilerleme hızını ve salınım frekansını ampirik olarak istenen seviyeye ayarlayın.
    not: Her iki ayar da düşük aralıkta olmalıdır. En iyi sonuçlar için, bıçak kolunun tek bir geçişi yaklaşık 20 saniye sürmeli ve salınım, açık bir uğultu olmadan çok yumuşak ve hafif bir uğultu sesi üretmelidir.
  8. İlgilenilen beyin bölgesi tamamen kesilene kadar dokuyu 300 μm'lik artışlarla (veya tercih edilen başka bir kalınlıkta) ilerletmeye ve dilimlemeye devam edin; dilimleme işlemi için toplam süre 15 dakikadan az olmalıdır.

2. Optimize Edilmiş NMDG Koruyucu Kurtarma Prosedürü

  1. İlk NMDG geri kazanım adımı (kritik adım): Kesit alma prosedürünün tamamlanmasının ardından, kesilmiş plastik bir Pasteur pipeti kullanarak tüm dilimleri toplayın ve bunları 150 mL NMDG-HEPES aCSF ile doldurulmuş önceden ısıtılmış (34 °C) bir ilk geri kazanım odasına aktarın. Tüm dilimleri kısa bir süre içinde art arda aktarın ve tüm dilimler geri kazanım odasına taşınır taşınmaz bir zamanlayıcı başlatın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmedi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sıkıştırma VF-200Hassas AletlerVF-200Titreşimli doku dilimleyici (önerilir)
N-metil-D-glucaminSigma AldrichM2004aCSF bileşeni
Sodyum KlorürSigma AldrichS3014 SerisiaCSF bileşeni
Potasyum KlorürSigma AldrichP5405 SerisiaCSF bileşeni
Sodyum Fosfat monobazik dihidratSigma Aldrich71505aCSF bileşeni
Sodyum BikarbonatSigma AldrichS5761 SerisiaCSF bileşeni
HEPES ÜNİVERSİTESİSigma AldrichH4034aCSF bileşeni
glikozSigma AldrichG7021aCSF bileşeni
Sodyum AskorbatSigma AldrichA4034aCSF bileşeni
TiyoüreSigma AldrichT8656aCSF bileşeni
Sodyum piruvatSigma AldrichP5280 SerisiaCSF bileşeni
Kalsiyum klorür dihidratSigma AldrichC7902aCSF bileşeni
Magnezyum Sülfat heptahidratSigma AldrichM1880aCSF bileşeni
Kavisli künt forsepsGüzel Bilim Araçları11065-07Beyin diseksiyon araçları
İnce diseksiyon makası (supercut)Güzel Bilim Araçları14058-09Beyin diseksiyon araçları
Büyük ağır hizmet tipi makas 7 ''Güzel Bilim Araçları14000-18Beyin diseksiyon araçları
Metal spatulaSigma AldrichZ511455-1PAKBeyin diseksiyon araçları
Tıraş bıçaklarıVWR (VWR)89031-954Beyin diseksiyon araçları
Beyin Dilimi Bekçisi-4Bilimsel OtomatikleştirmeS-BSK4beyin dilimi tutma odası
naylon örgüWarner Enstrümanları64-0198Küçük dilim geri kazanım odaları inşa etmek için
Pyrex cam kaplar (250 mL)VWR (VWR)89090-434Küçük dilim geri kazanım odaları inşa etmek için
35 mm plastik tabak, yuvarlakVWR (VWR)100488-376Küçük dilim geri kazanım odaları inşa etmek için
Gaz difüzör taşları (10 μm)Sigma Aldrich59277Sürekli karbojenasyon için (ince kabarcıklar)
Agaroz Tip I-BSigma AldrichA0576Beyin örneklerini gömmek için
hidroklorik asitSigma AldrichH1758-100MLOrtamın pH ayarlaması için
Sodyum HidroksitSigma Aldrich221465-25GOrtamın pH ayarlaması için
Potasyum HidroksitSigma Aldrich221473Ortamın pH ayarlaması için
Plastik transfer pipetleri 3 mL dereceliVWR (VWR)89497-676Dilim transferi için
Zirkonyum seramik enjektör bıçaklarıCadence Özel BıçaklarEF-INZ10http://cadenceinc.com/
Isıtmalı su banyosu (2,5L)VWR (VWR)13491-060çeşitli
Filtre kağıdı yuvarlaklarıVWR (VWR)28456-022çeşitli
Siyanoakrilat yapıştırıcıAmazonB000BQRBO6çeşitli
Cam petri kabıVWR (VWR)89000-326çeşitli
10X Fosfat tamponlu salinSigma AldrichP5493 Serisiçeşitli
Termomikser (1,5 mL tüp bloğu ile)VWR (VWR)89232-908Agarozu erimiş tutmak için
Serisi · Serisi · · · · · Serisi · Serisi · Serisi · Serisi · · Serisi · Serisi arası · Serisi · · Serisi · Serisi · · Serisi arası ·

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

NMDG HEPES aCSFBrain SectioningAcute Brain SlicesProtective Recovery MethodArtificial Cerebrospinal FluidAgarose EmbeddingVibratome SlicingSlice Recovery ChamberNeuronal Cell ViabilityElectrophysiological Properties

İlgili makaleler