Retinanın nöronal dokusunun uzun süreli inkübasyonu için bir teknik

Özet

Kaynak: Cameron, M. A., et al. Elektrofizyoloji ve Kalsiyum Görüntüleme için Akut Nöronal Dokunun Uzun Süreli İnkübasyonu. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu video, retinanın nöronal dokusunun uzun süreli inkübasyonu için bir yöntemi göstermektedir. Retina içeren vizör taneleri bir fare gözünden elde edilir; iç sınırlayıcı zar (ILM), retinanın nöronal hücrelerini açığa çıkarmak için enzimatik olarak sindirilir ve tedavi edilen göz kabı veya izole retina, düşük bir sıcaklıkta uzun süreli inkübasyon için özel bir inkübatöre aktarılır.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Retinal Wholemount Hazırlığı ve İç Sınırlayıcı Membranın Çıkarılması

1. Normal laboratuvar aydınlatma koşulları veya loş kırmızı/kızıl ötesi ışık altında retinal tam montajları hazırlayın.
2. Hayvanı servikal çıkık ile ötenazi yapın ve hemen gözleri enüklee edin. Ora serrata boyunca küçük bir kesim yapın ve (mM) içeren Ames ortamına veya yapay beyin omurilik sıvısına (aCSF) yerleştirin: 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 3 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 glikoz, 0.5 L-glutamin ve karbojen (% 95 O2/5% CO₂ karışımı; ~ 300 mOsm; pH 7.4) ile doyurun, oda sıcaklığında (RT).
3. Ora serrata boyunca küçük bir makasla keserek ve lensi ve vitreusu forseps ile çıkararak kornea, lens ve vitreusu hemen çıkarın. Dokuyu RT.
   adresindeki inkübasyon sistemine yerleştirin not: Retina dokusu, sıcaklığın 15 - 16 ° C'ye yavaş yavaş düşürülmesinden sonra, ihtiyaç duyulana kadar inkübasyon sisteminde >24 saat boyunca göz kabında tutulabilir.
4. ILM'yi çıkarmak için, retinayı içeren vizör lastiğini 30 U/mL papain, 1 mM L-sistin, 0.5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve %0.005 deoksiribonükleaz (DNaz) içeren küçük bir cam kavanoza aktarın. Earl'ün Dengeli Tuz Çözeltisinde (BSS) 37 ° C'de 20 dakika boyunca% 95 O₂/% CO₂ uygulayın, ancak kabarcık yapmayın. Genç hayvanlardan (<6 hafta) doku kullanılıyorsa, çözeltiyi yarı kuvvette seyreltin.
   1. Earl's BSS'de dokuyu 10 dakika boyunca bir ovomukoid (10 mg / mL) ve sığır serum albümini (BSA, 10 mg / mL) çözeltisine yerleştirerek enzimatik sindirimi durdurun. İnkübasyon sistemine aktarmadan önce dokuyu aCSF ile iyice yıkayın ve sıcaklığı 15 - 16 ° C'ye düşürün.
5. İhtiyaç duyulana kadar vizör lastiğindeki retina dokusunu koruyun. Mikroskoba aktarmak için retinayı vizör lastiğinden izole edin ve bir jiletle 4 parçaya bölün. Retinanın tamamı gerekliyse, düz durmasını sağlamak için retinanın çevresinde dört küçük kesi yapın.
   not: Görüntüleme deneyleri için, inkübasyon sistemine aktarmadan önce kalsiyum boyalarla yükleyin, aşağıya bakın.

2. İnkübatörde Doku Bakımı

1. Dokuyu pH ve sıcaklık ölçümleri için problar içeren ana hazneye yerleştirin (Şekil 1A, B).
2. Çözelti içinde yüzen bakterileri yok etmek için aCSF'yi ana odadan izole edilmiş ve 1,1 W ultraviyole C (UVC) ışığına (254 nm, 5W/2P sterilizatör UV lambası) maruz bırakan ikinci bir odadan (UVC odası, daha önce açıklandığı gibi inşa edilmiştir) dolaştırın (Şekil 1A). aCSF'nin aşırı ısınmasını önlemek için her 15 - 30 dakikada bir 15 ila 26 dakika arasında değişen zamanlarda AÇILAN rastgele bir özellik kullanarak programlanabilir bir zamanlayıcı aracılığıyla UVC ışık zamanlamasını kontrol edin.
3. UVC odasındaki akış hızını daha önce bildirildiği gibi 12 mL/dk'ya ayarlayın. Nöronal dokuya zarar verebilecek UVC aydınlatmasını önlemek için odanın dışında UVC aydınlatmasını önlemek için UVC odasını alüminyum folyo ile kapatın.
   not: Karanlığa adapte olmuş retina dokusu için, ışığı dışarıda bırakmak için ana odaya özel yapım bir kapak uygulayın.
4. Çözeltiyi (aCSF) iki hazne boyunca dolaştırmak için bir peristaltik pompa ve ana hazneyi 0 - 50 °C aralığında istenen sıcaklıklara soğutmak veya ısıtmak için bir Peltier termoelektrik soğuk plakalı soğutucu kullanın. Optimal doku inkübasyonu için, uzun süreli canlılık için 15 - 16 °C kullanın.

Sonuçlar

Şekil 1. Doku ortamının sıkı bir şekilde düzenlenmesini sağlayan bir inkübasyon sistemi. A, Bir soğutma Peltier plakası, ana oda, peristaltik pompa ve UVC odasından oluşan inkübasyon sisteminin şematik diyagramı. B, aCSF'nin giriş ve çıkış noktalarının yanı sıra karbojen girişi, sıcaklık ve pH problarını gösteren ana haznenin yandan görünümü. Doku, belirtildiği gibi ağ üzerine yerleşt...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Sodyum Klorür	Sigma Aldrich VETEC	V800372
Potasyum klorür	Sigma Aldrich	P9333 Serisi
N-Metil-D-glucamin	Sigma Aldrich	M2004
D-glikoz	Sigma Aldrich	G5767
Sodyum bikarbonat	Sigma Aldrich	S6014 Serisi
Magnezyum klorür	Sigma Aldrich	M9272
Kalsiyum klorür	Sigma Aldrich	223506
Papain Ayrışma Sistemi	Worthington	LK003150
Sabit Kademeli Dik Mikroskop	Olympus	BX51WI
Mikroskop Amacı	Olympus	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20 katı
Mikroskop Amacı	Olympus	LUMPlanFLN 60x/1,00w	60 katı
Beyin küpü	Payo Bilimsel	BR26021976	www.braincubator.com.au
Peltier-Termoelektrik Soğuk Plakalı Soğutucu	TE Teknolojisi	CP-121
Sıcaklık kontrolörü	TE Teknolojisi	TC-36-25 RS232