1. Malzemelerin ve Kültür Ortamının Hazırlanması
- SCZ'nin (Subkallozal bölge) diseksiyonu ve ayrışması için beyin matrisini, çift kenarlı tıraş bıçağını ve forsepsleri alüminyum folyo ile sarın ve ardından otoklavlayarak sterilize edin.
- Tüm fare beynini yıkamak için 50 ml soğuk PBS (Fosfat tamponlu salin) tamponu hazırlayın.
- Bir diseksiyon mikroskobu kurun ve beynin diseksiyonu (otoklavlı makas ve forseps) ve SCZ'nin izolasyonu (1 ml şırınga, 30 G iğne, beyin matrisi ve ince forseps) için gerekli cerrahi aletleri hazırlayın.
- N2 Ortamının Hazırlanması:
- % 2 B27,% 1 N2 takviyesi ve% 1 Penisilin-Streptomisin içeren F-12 / DMEM (+L-glutamin, + sodyum bikarbonat) ortamı hazırlayın.
Not: Büyüme ortamı N2 ortamı ve büyüme faktörlerinden (20 ng/mL saflaştırılmış epidermal büyüme faktörü (EGF) ve 20 ng/mL bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF2)) oluşur.
- Doku sindirimi için bir sindirim tamponu (40 birim / ml papain, 2.4 birim / ml dispas II ve PBS'de% 2 penisilin-streptomisin) hazırlayın.
- Kaplama Plakası ve lamel hazırlanması:
- Poli-L-ornitin (PLO;% 0.01) ve laminin (DH2O'da çözünmüş 10 μg / ml) hazırlayın. SCZ-aNSC'lerin (Yetişkin nöral kök hücreler) bakımı için 6 oyuklu plakaları tek tabaka veya immün boyama için 18 mm lameller olarak kaplamak için, bunları gece boyunca 4 ° C'de PLO ile inkübe edin. Daha sonra DH2O ile 3 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra plakaların ve lamellerin kurumasını bekleyin.
- Daha sonra, plakaları laminin ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Daha sonra DH2O.
ile 3 kez yıkayınız.
Dikkat: Hücre bağlanmasını etkileyecek laminini kurutmayın.
Not: Kaplama çözeltileri 3 kez tekrar kullanılabilir.
2. Yetişkin SCZ'nin İzolasyonu ve Ayrışması
- Kültür hazırlığından önce, beyin matrisini ve çift ucu keskin tıraş bıçağını buzun üzerine yerleştirin.
Not: Beyin matrisini dondurmayın, çünkü beyin ona bağlanabilir.
- CO2 boğulması veya servikal çıkık ile bir fareyi (8 haftalık) feda edin.
- % 70 etanol püskürttükten sonra kafayı keskin bir makasla kesin. Başı hareketsiz hale getirmek için başın her iki tarafını da sıkıca tutun. Cildi orta hatta makasla kaudal-rostral yönde kesin. Bu, cildin kafatasından tamamen çıkarılmasını teşvik eder.
- Önce kafatasının kaudal kısmını (lambdanın arkasında) çıkarın ve ardından forsepsleri dorsal orta hat pozisyonunda kafatası ile beyin arasına yerleştirin. Sol (veya sağ) parietal kemiği tutun ve dikkatlice soyun. Diğer parietal kemiğin çıkarılması için bu işlemi tekrarlayın.
Not: Optik sinirin bağlantısının kesilmesi ve beyin zarlarının beyinden çıkarılması, beynin kafatasından ayrılmasını kolaylaştırır.
- Beyni soğuk PBS tamponuna (25 ml) aktarın ve fazla kanı çıkarmak için iki kez durulayın.
- Beyni buz üzerindeki beyin matrisine yerleştirin ve 1 mm kalınlığında dilimler elde etmek için koronal kesimler yapın. Beynin arka kısmında yer alan SCZ bölgelerini içeren beyin dilimlerini (1 mm) 35 mm'lik plastik bir petri kabında soğuk bir PBS'ye aktarın.
Dikkat: Paralel bir koronal kesit düzlemi elde etmek için, beyin fissürünün beyin matrisinin orta hattına yerleştirildiğinden emin olun; Bölümlerde gereksiz değişikliklerden kaçınmak çok önemlidir.
not: Bregmanın 2-3 mm posteriorunda beyin dilimleri elde edin; bu, SCZ'nin SVZ'den (subventriküler bölge) ayrılmasına izin verir.
- Düşük büyütmeli diseksiyon mikroskobu altında, SCZ'yi korteks ve hipokampusun beyaz madde alanından bükülmüş bir 30G iğne ile mikro diseksiyon yapın6,9. Ardından, SCZ'nin üzerindeki korteks bölgelerini çıkarın. Dilimlerden disseke edilmiş SCZ bölgesini soğuk PBS.
olmadan buz üzerinde 35 mm'lik plastik bir petri kabına yerleştirin
not: Olgun nöronlar içeren ekstra bölgelerin kontaminasyonu, aNSC kültür koşullarında hücre ölümüne uğradıkları için aNSC'lerin canlılığını ve nörosfer oluşumunu etkileyebilir.
- Bükülmüş 30 G'lik bir iğne kullanarak, kesilen dokuları hemen küçük parçalar halinde doğrayın.
not: SCZ dokusunun diseke edilmesi için daha uzun bir süre gerekiyorsa, diseke edilen dokuları doğramadan önce soğuk PBS'ye daldırın.
- Doğranmış dokuyu 1 ml sindirim tamponu ile tekrar süspanse edin, dokuyu 2 ml sindirim tamponu içeren 15 ml'lik bir tüpe aktarın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda 30 dakika inkübe edin><.
not: İyice karıştırmak için tüpü her 10 dakikada bir çalkalayın.
3. Subkallozal Zondan Kaynaklı Erişkin Nöral Kök Hücre Kültürü
- Sindirilmiş dokuyu ayırmak için tüpe hafifçe vurun ve ardından tüpü 5 dakika boyunca 145 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın, sindirim tamponunu yıkamak için sindirilmiş dokuyu 1 mL önceden ısıtılmış N2 ortamı ile yeniden süspanse edin ve numune solüsyonunu bir P1000 pipeti kullanarak en fazla 5 kez nazikçe pipetleyin.
not: Dar bir pipet ucuyla aşırı öğütme, hücre canlılığını ve müteakip büyümeyi azaltabilir.
- Tüpü 5 dakika boyunca 145 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini 1 ml N2 ortamında yeniden süspanse edin.
- Kaplanmamış 6 oyuklu bir plakada 1 ml N2 ortamı hazırlayın ve 2 ml'lik bir son hacim elde etmek için 1 ml askıda hücre ekleyin.
- Her oyuğa EGF (20 ng/ml) ve bFGF (20 ng/ml) ekleyin. Eklenen büyüme faktörlerini kaplanmış hücrelerle karıştırmak için 6 oyuklu kültür kabını elle hafifçe çalkalayın. 6 oyuklu plakayı 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatörde tutun.
- 8 gün boyunca her gün her kuyucuğa EGF (20 ng/ml) ve bFGF (20 ng/ml) ekleyin. Her üç günde bir, ortamın yaklaşık 2 ml hacmini korumak için 200 μl N2 ortamı ekleyin.
4. NSC'lerin Nörosfer Olarak ve Tek Katmanlı Kültürlere Geçişi
- Nöroküreleri toplayın ve bunları 15 ml'lik yeni bir konik tüpe aktarın.
Not: Tek bir fare beyninin SCZ'sinden oyuk başına nörosfer sayısı (>50 μm çap) 64.3 ± 7.31 idi, bu da SVZ'ninkinden (190.5 ± 6.33) daha azdı.
- Nörosferleri tek hücrelere ayırmak için nörosferleri 37 ° C'lik bir su banyosunda 5 dakika boyunca 0.5 ml ayrışma tamponu ile inkübe edin. Birincil nörosferler, tek hücrelere ayrılabilir ve nörosferler veya tek katmanlı kültürler olarak birkaç geçiş boyunca korunabilir.
not: SCZ-aNSC'lerin tek tabaka olarak genişletilmesi nörosferlerden daha üstündür çünkü SCZ-aNSC'ler tek tabakalı bir kültür formatında >10 kez, ancak nörosfer kültür formatında <5 kez geçilebilir.
Dikkat: SCZ-aNSC'ler güçlü agregasyon sergiler ve bunları tek hücrelere ayırmak zordur. Bu nedenle, rutin hücre genişlemesi için nörosfer kültür formatı önerilmez.
- Numune çözeltisini bir P1000 pipeti ile 5 defadan daha az bir şekilde yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin ve tüpü 145 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve nörosferleri 1 ml N2 ortamı ile yeniden süspanse edin.
not: Dar bir pipet ucuyla aşırı türleme, hücre canlılığını ve sonraki büyümeyi azaltabilir.
- Hücreleri saymak için, hücre süspansiyonu (10 μl) ve% 0.4 tripan mavisi çözeltisinin 1: 1 karışımını yapın ve ardından bir hematositometredeki canlı hücre sayısını sayın. 6 oyuklu bir plakayı PLO / laminin ile kapladıktan sonra, hücreleri 2.5 x 105 hücre / ml'de her kuyucuk için 2 ml N2 ortamı ile kaplayın.
not: Hücre yoğunluğundaki değişiklikler durumlarını ve farklılaşma potansiyellerini etkileyebilir.
- SCZ-aNSC'leri 5 gün boyunca günlük büyüme faktörleri (2 ml, 20 ng / ml) tedavisi ile koruyun ve ardından bunları geçirin.
5. Subkallozal Zon Kaynaklı Erişkin Nöral Kök Hücrelerin Farklılaşması
- SCZ-aNSC'lerin farklılaşması için büyüme faktörleri (20 ng/ml) ile 1 ml N2'de 1 x 105 hücre/ml ile FKÖ/Laminin kaplı 18 mm'lik bir lamel üzerine plaka aNSC'leri.
- Ertesi gün, hücreler lamel üzerine sıkıca tutturulduğunda, büyüme faktörlerini uzaklaştırmak için büyüme ortamını N2 ile değiştirin.
- 6 gün sonra, hücre kalıntılarını gidermek ve immün boyama için sabitlemek için farklılaşmış hücreleri 1 ml PBS ile yıkayın.
Not: BrdU, çoğalan hücrelerin yeni sentezlenen DNA'sına dahil edilebilir. Bu nedenle istenirse hücrelerin fiksasyonundan önce canlı hücrelere BrdU (10 μg/ml) eklenebilir.
