Çapraz iletişim için dental pulpa hücreleri ve trigeminal nöronların ortak kültürünün oluşturulması

Özet

Kaynak: Barkley, C. et al., Dental Pulpa Parakrin Sinyallerine Yanıt Olarak Nörit Büyümesini İncelemek İçin Bir Ko-Kültür Yöntemi.J. Vis. Uzm. (2020).

Bu videoda, bir transwell filtresi kullanarak trigeminal nöronların ve birincil diş pulpası hücrelerinin ko-kültürünü oluşturmak için bir teknik gösterilmektedir. Fiziksel olarak ayrılmış bu durumda, diş pulpası dokusundan elde edilen mezenkimal hücreler, gözeneklerden geçen parakrin sinyal molekülleri salgılar ve nöronların mezenkimal hücrelere doğru farklılaşmasını ve göçünü teşvik ederek bir ko-kültür sistemi oluşturur.

Protokol

1. Plaka Hazırlama

NOT: Numune işleme sırasında kontaminasyonu önlemek için steril doku kültürü başlığının dışındaki tüm inkübasyon ve durulama adımları sırasında plaka kapağının açık olduğundan emin olun.

1. Kaplama filtreleri
   1. Laminini 10 μg / mL'ye seyreltin. Kaputun altındaki seyreltilmiş laminini süzün.
   2. 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 450-500 μL 10 μg/mL laminin pipetleyin.
   3. Laminin çözeltisiyle temas edecek şekilde bir kuyuya 3 μm gözenekli bir transwell filtresi yerleştirin ve 2 saat veya gece boyunca 37 ° C'lik bir inkübatörde bırakın. Filtre gözenekleri, çözeltinin bir kısmının yayılmasına ve filtrenin hem üstünü hem de altını kaplamasına izin vermelidir. Bu filtreler 48 saat içinde kullanılmalı veya 4 °C'de 1 haftaya kadar buzdolabında saklanmalıdır.

2. Hücre Kaplama

1. Fareler: Mezenkimal nöronal etkileşimleri incelemek için diş pulpası (DP) hücrelerinin genetik modifikasyonu yapılabilir (ancak gerekli değildir).
2. DP diseksiyon, dispersiyon ve kaplama (Şekil 1)
   NOT: DP diseksiyonu için ultra ince, düz kenarlı forseps kullanın. Ultra ince kenarlar, kullanıcının mineralize yapı ile DP dokusu arasındaki forseps kenarını sıkıştırmasına izin verecektir.
   1. P5-P8 farelerini hasat edin. Bu aşamada dişlerin mineralize olması ve kökün açık olması gerekir.
   2. Yenidoğanları hipotermi yoluyla, artık hareket etmeyene veya dokunmaya tepki vermeyene kadar 4 ° C'lik buzdolabında bir tabağa koyarak uyuşturun. Yenidoğanlara dekapitasyon yoluyla ve belirlenen tesiste Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) prosedürlerine uygun olarak ötenazi yapın.
   3. Her fareden DP'yi toplamak için 50 mL'lik konik bir tüpte %0.25 tripsin-etilendiamin tetraasetik asitten (tripsin-EDTA) 3-5 mL'lik bir alikot hazırlayın. Bu, doğum sonrası farelerden diş pulpasının sindirimini kolaylaştıracaktır. 10'dan fazla doğum sonrası fareden doku sindiriyorsanız 3 mL'den fazla kullanın.
   4. Başlığı, ağız tavana doğru ve boynun tabanı çalışma yüzeyinde düz olacak şekilde tek kullanımlık bir alt ped üzerine yerleştirin. Mandibulayı maksilladan ayırmak için testere hareketiyle bir tıraş bıçağı kullanın.
   5. İsteğe bağlı olarak, azı dişlerine daha kolay erişim sağlamak için dili makasla veya forseps ile çıkarın.
   6. Açılan kafayı steril bir gazlı bez pedin üzerindeki bir tabağa yerleştirin ve numuneyi bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin (Şekil 1D).
   7. Birinci azı dişlerini çevreleyen alveol kemik dokusunu çıkarın. Submandibular dişler bu noktada tam olarak sürmez. Forsepsleri alveolar açıklığa yerleştirin ve dokuyu dişten ağzın bukkal (yanak) veya lingual (dil) tarafına doğru uzaklaştırın. Maksiller dişler, maruz kalma ve çıkarma için dişin etrafındaki yarığın tamamen çıkarılmasını gerektirecektir.
   8. Submandibular ve maksiller birinci azı dişlerini (M1'ler) 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içeren ayrı bir hücre kültürü kabına nazikçe aktarın.
   9. Tüm M2.2.4'ler toplanana kadar 2.2.8-1'i tekrarlayın. Hasat sırasında M1'leri içeren tabağı buz üzerinde tutun.
   10. Her M1'in dışını çevreleyen Emaye Dış Organını (EOE) çıkarın. Bu, alternatif olarak 2.2.11 adımından sonra yapılabilir.
   11. Bir dizi forseps ile M1'i, uçlar aşağı gelecek ve açık kök açığa çıkacak şekilde döndürün. Dişin alt kısmında oval bir açıklık ve ince bir dentin ve mine tabakası ile kaplanmış opak DP dokusu olacaktır.
   12. Forsepsin ucunu kullanarak, forsepsin bir kolunu mineralize dokunun iç çevresi etrafında gezdirerek DP'yi nazikçe gevşetin. DP dokusunu mineralize yapıdan çıkarın ve 1x PBS içeren üçüncü bir kaba aktarın. Henüz ayrılmamışsa EOE'yi çıkarın (Şekil 1E).
   13. Tüm DP dokusunu 50 mL'lik konik bir tüpte% 0.25 tripsin-EDTA'ya aktarın. Karışımı vorteksleyin ve 10 dakika boyunca 37 ° C'lik bir ılık su banyosuna koyun. Bu, aynı forseps ile veya uzun, flakon forseps ile yapılabilir. Dokunun dağılması zor olacak ve her 3-4 dakikada bir girdap gerektirecektir. Tripsin hücre zarlarına zarar verebileceğinden 10 dakikalık tripsinizasyonu aşmayın.
   14. Steril bir başlık altında, enzimi etkisiz hale getirmek için ısıtılmış ko-kültür ortamını (Tablo 1) en az 1: 1 ortamın tripsine nihai oranına ekleyin. Daha fazla doku dispersiyonu isteniyorsa daha büyük oranlar kabul edilebilir.
   15. DP'yi ortamda daha fazla dağıtmak için ortamı 10 mL'lik bir pipetle birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Büyük baloncuklardan kaçınmaya dikkat edin. Dokunun yapışkan doğası nedeniyle tam dispersiyon neredeyse imkansızdır. Bununla birlikte, hücreler kaplandıktan sonra dokudan dışarı doğru göç edeceği için de gerekli değildir.
   16. Dağılmış DP'nin 1 mL'sini 24 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğuna aktarın (Şekil 1F).
   17. Plakayı 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin ve ortamı değiştirmeden önce hücrelerin dağılmamış dokuya yapışmasına ve göç etmesine izin verin. Birincil hücrelerin 1 hafta içinde% 85-90 birleşmeye ulaşmak için nispeten yüksek konsantrasyonlarda kaplanması gerekir. 1 hafta sonra bu elde edilmezse, plakayı atın.
3. Trigeminal nöron diseksiyonu, dispersiyonu ve kaplaması
   NOT: Bu protokolde, DP hücreleri ile ko-kültürde nörit büyümesinin görüntülenmesi, ergen (6 haftalık) B6 kullanılarak optimize edildi. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J fareler. Thy1-YFP farelerinin merkezi ve periferik sinir sistemleri, ekspresyonu nöronlarda P6-P10 civarında başlayan ve doğum sonrası ve yetişkin yaşamı boyunca sinir sistemi boyunca katlanarak artan sarı bir floresan protein (YFP) etiketine sahiptir. YFP ve GFP, bu sinirlerin anti-GFP antikorları ile boyanmasına izin veren ve pan-nöronal bir lekelenmeye neden olan korunmuş dizilere sahiptir. Sonuç olarak, bu fareler, hücre kültüründe kullanılan ve büyütülen nöronların daha iyi görselleştirilmesine ve ölçülmesine izin verir.       
   1. Ergen farelere karbondioksit ile ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık yapın.
   2. Farelerin kafasını kesin ve cildi kafatasından çıkarın. Eşdeğer sayıda erkek ve kadın eklediğinizden emin olun.
   3. Bir çift mikro diseksiyon makasının ucunu kafatasının tabanına yerleştirin. Kafatasının sagital sütürü boyunca kesin (Şekil 1A).
   4. Dört küçük yatay kesim yapın: ikisi kulakların yanındaki koronal dikişler boyunca ve ikisi kafatasının tabanındaki lambdoid dikişler boyunca. Bu iki kemik flebi oluşturmalıdır.
   5. İki kemik kanadını soymak için forseps kullanın. Bu beyni ortaya çıkarmalıdır.
   6. Beyni çıkarın. Kafayı 1x PBS'li bir doku kültürü kabına aktarın ve mikroskop altına koyun.
   7. Kemirgenlerde¹³ kolayca görülebilen trigeminal (TG) gangliyonları, maksiller sürecin beyin ve kemiği arasındaki dura materde bulunur (Şekil 1B).
   8. Gözlere, maksillaya ve mandibulaya giden üç dalı kesin ve gangliyonları düz kenarlı ince forseps kullanarak soğuk 1x PBS'ye aktarın. Hasat sırasında TG gangliyonlarını içeren tabağı buz üzerinde tutun.
   9. Tüm TG demetleri hasat edildikten sonra, gangliyonları flakon forseps kullanarak 5 mg / mL steril filtreli kollajenaz tip II içeren 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
   10. Kollajenazı TG demeti ile vorteksleyin ve tüpü 25-30 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Bu süre zarfında konik boruyu su banyosundan, girdaptan çıkarın ve her 5-10 dakikada bir banyoya geri dönün.
   11. Kollajenaz-TG nöron çözeltisini 643 x g'da 2 dakika santrifüjleyin.
   12. Bir doku kültürü başlığı altında, kollajenazı bir mikropipet ile nazikçe aspire edin.
   13. 5 mL% 1 steril filtrelenmiş tripsin tip II ve girdap ekleyin. Konik boruyu 5 dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.
   14. Tripsin-TG karışımını 643 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Tripsinin üst kısmını bir mikropipet ile çıkarın, böylece TG nöronları çıkarılmaz. Tüpte hala sıvı olacaktır.
   15. Kalan tripsini devre dışı bırakmak için yeterli medya ekleyin (1: 1 veya daha düşük bir tripsin / medya oranında).
   16. Hücre sayısını sayın ve çözeltiyi 200.000 hücre / mL'ye (250 μL hücre içeren 50.000 hücre) seyreltin.
   17. Bölüm 1.2'deki kaplanmış transwell filtrelerini DP ile kuyulara yerleştirin.
   18. Hücre içeren çözeltiyi 200.000 hücre / mL olacak şekilde seyreltin. Transwell filtreye 250 μL pipetleyin ve hücreleri gece boyunca 37 °C'de kültürleyin (Şekil 1F).
   19. Ertesi gün, nörit büyümesini önleyebilecek mezenkimal hücrelerin aşırı proliferasyonunu durdurmak için ortamı 1 μM üridin ve 15 μM 5'-floro-2 deoksiüridin içeren 1 mL Ko-kültür ortamı ile değiştirin. İsteğe bağlı: Daha fazla manipülasyon yapmaya çalışıyorsanız, bu ortama büyüme faktörleri veya inhibitörler ekleyin.

Tablo 1: Ortak kültür ortamı.

parça	hacim	konsantrasyon
MEM α	440 mL
Isı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu	50 mL	%10
100x L-glutamin	5 mL	1 katı
Penisilin-streptomisin 100 x	5 mL	1 katı
Bu son konsantrasyonlarda mitotik inhibitörlerle 2. günde ortamı değiştirin
üridin		1 μM
5'-Flor-2'deoksiüridin		15 μM

Sonuçlar

Şekil 1: Ko-kültür için hücreler elde etmek için fare diseksiyonunun şeması.(A) Son tasvirde siyah renkle gösterilen, fare kafatasını açmak ve TG sinirlerini bulmak için nerede kesileceğine dair bir diyagram. Makas, noktalı çizgiler boyunca kesmek için makas uçlarının nereye yerleştirileceğini gösterir. (B) Thy1-YFP+ TG sinirlerini beyaz daire içine alınmış olarak gös...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
5-Floro-2'-deoksiüridin	Sigma-Aldrich	F0503	Ko-kültür ortamında 15 μM konsantrasyonda mitotik İnhibitör olarak kullanılır, 2. Gün
24 Kuyulu Hücre Kültürü Plakası	Corning	3524	Ko-kültür plakası
B6; 129- Tgfbr2tm1Karl/J	Jackson Laboratuvarı	12603	Optimize edilmiş protokolde dental pulpa hücreleri için kullanılan Tgfbr2f/f fare modeli
B6. Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J	Jackson Laboratuvarı	3709	Trigeminal nöronlar için kullanılan Thy1-YFP fare modeli genotipi
Kollajenaz Tip II	Kırlangıç	234155-100MG	Trigeminal nöronları dağıtmak için kullanılır
Fetal Sığır Serumu	Gibco (Gibco)	10437	Ortak kültür ortamına katkı maddesi
İnce forseps	Güzel Bilim Araçları	11413-11	TG diseksiyonu için ince forseps
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Transwell eklerini 10 μg/ml'lik nihai konsantrasyonda kaplar, stok çözeltisinin 1,5 mg/ml olduğu varsayılır
L-Glutamin	Gibco (Gibco)	25030081	Ortak kültür ortamına katkı maddesi
Mikro diseksiyon makası	Sigma-Aldrich	S3146-1EA	Kafatasını açmak için diseksiyon makası
Minimal Esansiyel Orta A	Gibco (Gibco)	12571063	Ko-kültür medya üssü
Penisilin-Streptomisin	Gibco (Gibco)	15070063	Ko-kültür ortamına antibiyotik katkı maddesi
Fosfataz İnhibitörü	Sigma-Aldrich	04 906 837 001	Ko-kültür sonrası diş pulpası hücrelerinden protein ekstrakte etmek için RIPA Buffer'a katkı
ThinCert Hücre Kültürü Eki	Greiner Bio-Bir	662631	Ko-kültür tahlillerinde trigeminal nöronlar için transwell ekleri
Tripsin-EDTA (% 0.25)	Gibco (Gibco)	25200056	Diş pulpası hücrelerini dağıtmak için kullanılır
Tripsin Tip II	Sigma-Aldrich	T-7409	Trigeminal nöronları dağıtmak için kullanılır
Ultra İnce Forseps	Güzel Bilim Araçları	11370-40	Diseksiyon için ultra ince forseps
üridin	Sigma-Aldrich	U3750	Ko-kültür ortamında 1 μM konsantrasyonda mitotik İnhibitör olarak kullanılır, 2. Gün
Flakon forseps	Güzel Bilim Araçları	110006-15	Koniklere doku transferi için uzun forseps

Gazetesi Serisi adet Gazetesi Yılı Gazetesi Serisi Gazetesi maddesi Gazetesi Serisi arası Gazetesi Serisi