1. İnsan Periventriküler Endotel Hücrelerinin Kültürü ve Saklanması
- İnsan periventriküler endotel hücrelerini, periventriküler endotel hücre ortamında (50 ng / mL vasküler endotelyal büyüme faktörü A [VEGF-A], 100 ng / mL fibroblast büyüme faktörü 2 [FGF2] ve 5 μM gama-aminobütirik asit [GABA] içeren E6 ortamı) bazal membran matris kaplı (Malzeme Tablosuna bakınız) 6 oyuklu plakalarda 37 ° C ve% 5 CO2'de koruyun. Ortamı her alternatif günde bir değiştirin.
- Bazal membran matrisini 4 °C'de çözdürün ve soğuk Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamı/besin karışımı F-12 (DMEM/F12) ortamında seyrelterek 1:100'lük bir çözelti hazırlayın. 6 oyuklu bir plakanın her bir kuyusunu 1 mL matris çözeltisi ile kaplayın. Plakaları kullanmadan önce en az 1 saat 37 °C'de inkübe edin.
- İnsan periventriküler endotel hücrelerinin% 80 -% 90'lık bir birleşmeye ulaşmasına izin verin. Kuyudan ortamı aspire edin. Kuyucukları bir kez kuyucuk başına 1 mL steril 1x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile yıkayın.
- Kuyucuk başına 1 mL hücre ayrışma çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek hücreleri ayırın. 37 °C'de 5 dakika inkübe edin. 5 dakika sonra, 1 mL periventriküler endotel hücre ortamı ekleyin. Hücre çözeltisini 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
not: Bölüm 3 ve 4'teki TrypLE'nin aksine, burada hücre ayrışması için Accutase kullanıyoruz.
- Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 1 mL periventriküler endotel hücre ortamında yeniden süspanse edin.
- Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak canlı hücreleri sayın. 1.2 x 105 hücre/cm2 yoğunlukta taze matris kaplı plakalarda tohum hücreleri. 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- İnsan periventriküler endotel hücrelerini dondurucu ortamda (% 90 periventriküler endotel hücre ortamı% ve% 10 dimetil sülfoksit [DMSO]) kriyoprezervasyon yaparak saklayın.
- Yukarıdaki 1.3 ve 1.4 adımlarını izleyerek hücreleri ayırın ve toplayın. Tripan mavisi dışlama yöntemi ile çözeltideki hücreleri sayın.
- Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 5 x 106 hücre / mL donma ortamında yeniden süspanse edin.
- Kriyovial başına 1 mL dondurma ortamı artı hücre dağıtın. Şişeleri izopropanol dolu hazneye yerleştirin ve gece boyunca -80 °C'de 1 °C/dk'da soğutun. Uzun süreli depolama için şişeleri ertesi gün sıvı nitrojen tankına aktarın.
2. İnsan Periventriküler Endotel Hücrelerinin Test için Hazırlanması
- İnsan periventriküler endotel hücrelerinin% 70 -% 80 birleşmesine ulaşmasına izin verin.
- Yukarıda açıklandığı gibi 1.3 ila 1.5 arasındaki adımları izleyerek hücreleri ayırın. Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak hücreleri sayın.
3. İnsan GABAerjik İnternöronlarının Test için Hazırlanması
>NOT: İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) türevi GABAerjik internöronlar ve nöronal ortam ticari olarak satın alınmıştır (bkz. Nöronlar, üretici tarafından geliştirilen bir protokolü takiben insan fibroblastından türetilmiş bir iPSC hattının ayırt edilmesiyle üretilir. Hücreler üreticinin protokolüne göre çözüldü ve kültürlendi.
- İnsan GABAerjik internöronlarını çözün ve bunları iki hafta boyunca 12 oyuklu plakada% 70 -% 80'lik bir birleşmeye kadar kültürleyin.
- Tahlil gününde, kullanmadan önce 10 dakika boyunca 37 ° C'de ılık hücre ayrışma çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bir nöronal ortam alikotu.
- Hücreleri içeren her oyuktan ortamı aspire edin. Hücreleri kuyucuk başına 1 mL steril 1x PBS ile yıkayın.
- Oyuk başına 0.5 mL önceden ısıtılmış ayrışma çözeltisi ekleyerek hücreleri ayırın ve 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Kuyu başına 1 mL nöronal ortam ekleyin. Hücre çözeltisini 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hücre kümelerini ayırmak için hafifçe ezin.
- Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 380 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 1 mL nöronal ortamda yeniden süspanse edin. Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak canlı hücreleri sayın.
4. Kontrol İnsan Endotel Hücrelerinin Test için Hazırlanması
>NOT: Kontrol insan iPSC'den türetilmiş endotel hücreleri ve endotel hücre ortamı ticari olarak satın alınmıştır (Malzeme Tablosu). Bu endotel hücreleri, üretici tarafından geliştirilen bir protokolü takiben insan fibroblastından türetilmiş bir iPSC hattının endotelyal kadere farklılaştırılmasıyla üretilir. Hücreler çözüldü ve üreticinin protokolüne göre Fibronektin substratı üzerinde kültürlendi. Fibronektin kaplı plaklar üretici protokolüne uygun olarak hazırlandı.
- Çözülme, insan endotel hücrelerini kontrol edin ve bunları 6 oyuklu plakada% 80 -% 90'lık bir birleşmeye kadar kültürleyin.
- Tahlil gününde, ılık hücre ayrışma çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve kullanımdan önce 10 dakika boyunca 37 ° C'de bir endotel ortamı alikotu.
- Hücreleri içeren her bir oyuktan ortamı aspire edin. Hücreleri kuyucuk başına 1 mL steril 1x PBS ile yıkayın.
- Kuyucuk başına 0.5 mL önceden ısıtılmış ayrışma çözeltisi ekleyerek hücreleri ayırın. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Ayrışma çözeltisini nötralize etmek için oyuk başına 1 mL endotel hücre ortamı ekleyin. Hücre çözeltisini 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
- Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 1 mL endotel hücre ortamında yeniden süspanse edin. Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak canlı hücreleri sayın.
5. Tek Kuyulu Kültür Eklerinin Hazırlanması
- 1 mg / mL laminin çözeltisini oda sıcaklığında veya gece boyunca 4 ° C'de çözdürün.
- Uygun sayıda 35 mm'lik bulaşıkları% 0.01 poli-L-ornitin çözeltisi (tabak başına 1 mL) ile kaplayın. Bulaşıkları oda sıcaklığında en az 1 saat inkübe edin.
- Kullanmadan hemen önce 1 mg / mL laminin solüsyonunu 1:300 steril suda 3.3 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin.
- Her tabaktan poli-L-ornitini tamamen aspire edin. Her kabı steril suyla 3 kez iyice durulayın ve poli-L-ornitin kaynaklı hücre toksisitesini önlemek için tamamen aspire edin.
- Her yemeğe 1 mL 3.3 μg/mL laminin solüsyonu ekleyin ve gece boyunca veya en az 1 saat 37 °C'de inkübe edin. Kullanmadan hemen önce laminin solüsyonunu tabaktan çıkarın.
not: Alternatif olarak, laminin içeren bulaşıkları 4 °C'de saklayın. Bulaşıkları kullanmadan önce 37 °C'lik bir hücre kültürü inkübatöründe dengeleyin.
- Tek oyuklu bir kesici uç oluşturmak için steril bir bıçak kullanarak iki oyuklu bir silikon kültür ekinin (Şekil 1A) bir oyuğunun üç tarafını kesin (Şekil 1B).
not: Düzgün bir kesim sağlamak ve ek parçanın yapışkanlığını korumak için kesim sırasında iki kuyulu ek parçayı orijinal ambalajın yüzeyine sıkıca bağlı tutun.
- Bulaşıklardan laminin solüsyonunu aspire edin.
not: Laminin inkübasyonundan sonra bulaşıkları steril PBS veya su ile yıkamayın. Islak yüzeyler, kültür ekinin sıkı yapışmasını önleyecektir.
- Steril cımbızla tek kuyulu eki çıkarın ve poli-L-ornitin/laminin kaplı kabın ortasına yerleştirin. Tabağın yüzeyine sabitlemek için ekin kenarları boyunca bastırın.
- Ek parçanın sıkıca yapıştığını doğrulamak için çanağı dikkatlice ters çevirin.
- Çanağı baş aşağı tutun ve ultra ince uçlu kalıcı siyah bir işaretleyici kullanarak ekleme bölmesinin sınırını işaretleyin (Şekil 1C).
>6. Ortak Kültür Göç Testi
- 3 x 104 GABAerjik internöron ve 3 x 104 insan periventriküler endotel hücresini 70 μL ko-kültür ortamında (GABA'sız %50 periventriküler idame ortamı ve %50 nöronal ortam) birlikte askıya alın. Bu hücre çözeltisini tek kuyucuklu yerleştirme bölmesinin içine tohumlayın. Uygun sayıda bu tür tahlil tabağı hazırlayın.
not: Ekzojen GABA'nın göç üzerindeki etkisini dışlamak için ko-kültür ortamına GABA eklenmedi.
- Hücrelerin ek bölmeden sızmadığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin.
- Kaplamanın kurumasını önlemek için yemeğin kenarına yavaşça 1 mL ko-kültür ortamı ekleyin.
not: Ek parçanın rahatsız edilmemesi için tabağın kenarı boyunca yavaşça orta ekleyin.
- İlk kontrol olarak, 3 x 104 insan GABAerjik internöronunu tek oyuklu ek parça başına sadece 70 μL ko-kültür ortamında tohumlayın. Uygun sayıda bu tür yemekler hazırlayın.
- İkinci bir kontrol olarak, 3 x 104 GABAerjik insan internöronunu 3 x 104 kontrol insan endotel hücresi ile tek oyuklu ek başına 70 μL ko-kültür ortamında birlikte tohumlayın. Uygun sayıda yemek hazırlayın.
- Bulaşıkları 37 ° C'de ve% 5 CO2'de 24 saat inkübe edin. 24 saatlik inkübasyondan sonra, hücrelerin düzgün bir şekilde bağlandığını ve sızıntı olmadığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin.
- 48 saatlik tohumlamadan sonra, steril bir cımbız kullanarak eki nazikçe çıkarın. Hücre tabakasının bozulmadığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin (0. gün).
- Besiyerini çıkarın ve 1 mL taze ko-kültür ortamı ekleyin.
not: 0. gün görüntülerini elde etmek için uygun sayıda yemek ayırın.
- Hücreleri 5 gün boyunca 37 ° C'de ve% 5 CO2'de inkübe edin.
