Organotipik Dilim Ko-kültür Modelinde Beyin Tümörü Kurulması

Özet

Kaynak: Chadwick, E. J. et al. Tümör Mikroçevresini ve Hedefe Yönelik İlaç Tedavilerini İncelemek için Bir Beyin Tümörü/Organotipik Dilim Ko-kültür Sistemi. J. Vis. Uzm. (2015).

Bu video, bir 3B ortak kültür sisteminin gelişimini göstermektedir. Fare beyni dilimleri bir zar üzerine yerleştirilir ve floresan olarak etiketlenmiş insan beyni tümör hücrelerinin üzerinde büyümesine izin verilir. Sistem hazır olduğunda, görüntüleme için boyanır.

Protokol

Numune toplama ile ilgili tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Dilimlerin Ekler Üzerine Kaplanması

1. 6 oyuklu bir plakanın her bir kuyusunu 1.200 μl dilim kültür ortamı ile doldurun. Kullanılmayan kuyucukları 1.200 μl PBS ile doldurun ve plakanın orta alanını 5 ml 1x PBS ile doldurun. Bu plakayı 37 °C'de saklayın.
2. Oluklu kaşık aletini kullanarak, ek parçadaki ortama bir beyin dilimi yerleştirin ve dilimi tamamen suya batırılacak şekilde hafifçe itin. Tüm dilimler için tekrarlayın.
3. Ek parçanın üstünden 1 ml dilim kültür ortamı çekmek için bir p1000 kullanın ve bunu kuyunun dibine dağıtın. Beyin diliminin etrafındaki agarozun kenarları görünür hale gelene kadar fazla ortamı çıkarın ve atın. Kalan dilimler için bunu yapın.
4. Ek parçayı forseps ile kenarından alın, eğin ve fazla ortamı çıkarın. Ardından, eki hızlı bir şekilde 1 ml dilim kültür ortamı içeren 35 mm'lik^2'lik bir tabağa aktarın. Dokunun etrafındaki agarozu çıkarmak için 2 çift keskin forseps kullanın, zarı germeye/hasar vermemeye, dilimlememeye veya zarda bir delik açmamaya dikkat edin (en kolayı, agarozun en kenarından bir yırtık yaparsanız, ardından agarozu her iki taraftan da ayırın). Ardından, eki 6 oyuklu plakaya geri getirin ve kalan dilimler için tekrarlayın.
5. Üfleyici kapalıyken bir doku kültürü başlığında (dilimlerin kurumasını önlemek için), her zardan agaroz parçalarını çıkarın.
6. Dilimleri adım 1.1'de hazırlanan 6 oyuklu plakaya aktarın ve plakayı 37 °C'de saklayın. Dilimleri 24-48 saat inkübe edin.

2. Dilim Kültür Ortamını Değiştirme

1. Adım 1.1'i 6 oyuklu yeni bir plaka ile tekrarlayın.
2. Üfleyici kapalıyken bir doku kültürü davlumbazında, ekleri taze dilim ortamı içeren yeni 6 oyuklu plakalara aktarın.

3. Tümör Hücrelerinin Dilim Üzerine Kaplanması

1. Cm-DiI boyasını sonikasyon yapın ve 2 dakika boyunca orta hızda döndürün.
2. Kaplama için kullanılan tümör hücrelerini 5 dakika boyunca 201 x g'da döndürün. Daha sonra 2 ml dilim kültür ortamında tekrar süspanse edin.
3. 2 ml hücre ve ortama 7 μl Cm-DiI ekleyin ve 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
4. Hücreleri 5 dakika boyunca 201 x g'da döndürün ve 200 μl dilimleme ortamında yeniden süspanse edin. Hücreleri ayırmak için hafifçe öğütün (10-20 kez veya pelet gidene kadar) ve ardından 1.000 μl toplam hacim elde etmek için 800 μl dilimleme ortamı ekleyin.
5. Tripan mavisi kullanarak canlı tümör hücrelerini sayın. Tümör hücrelerine hücrelerle aynı konsantrasyonda yeşil floresan mikroküreler ekleyin. Bu inert mikro küreler bir kontrol görevi görecektir. Hücre / mikroküre karışımını 5 dakika boyunca 201 x g'da döndürün ve istenen miktarda dilim kültür ortamında yeniden süspanse edin. 65 μl hacimde 6.000 hücre/dilim yoğunlukta plaka hücreleri. Dilim başına kaplanan hücre sayısı, tercihe ve kullanılabilirliğe bağlı olarak artırılabilir.
6. Doku kültürü başlığında, hücreleri 65 μl ortam/dilim halinde dilimin ortasına dağıtın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
HEPES ÜNİVERSİTESİ	Canlandırıcı	17504044
glikoz	Canlandırıcı	17502048
Pennisilin Streptomisin	Yaşam Teknolojileri	15140-122
HBSS (Türkçe)	Yaşam Teknolojileri	14185-052
B-27 Uzay Aracı	Yaşam Teknolojileri	17504-044
N2	Yaşam Teknolojileri	17502-048
Glutamax (Glutamaks)	Yaşam Teknolojileri	35050061
Nörobazal-A- Orta eksi fenol kırmızısı	Canlandırıcı	12349015
Düşük Erime Noktalı Agaroz	Promega	V2111 Serisi
Dilim Kültür Ekleri	Milipore	PICM0RG50
Laminin	Canlandırıcı	23017015
Cm-DiI	Canlandırıcı	V22888 (İngilizce
Mikro küreler	Yaşam Teknolojileri	F-21010

Fuar ) Serisi