$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. MEA'ların Hazırlanması
Not: MEA'lar bir cam alt tabaka, mikro fabrikasyon metal elektrotlar ve bir SU-8 polimer yalıtım katmanından oluşur. Bu çalışmanın amacı doğrultusunda, ticari olarak temin edilebilen MEA'lar, özelleştirilmiş bir elektrot dizisi düzeni ile sipariş edildi (Şekil 1 A & B). 68 elektrot, elektrotlar, elektrik kabloları ve yalıtım içermeyen 300 μm genişliğinde bir oluk ile iki bölgeye ayrılan dikdörtgen bir ızgarada düzenlenmiştir. Her elektrot 40 x 40 μm boyutundadır ve merkezden merkeze 200 μm aralıklarla yerleştirilmiştir. Kayıt alanının etrafına dört büyük toprak elektrodu yerleştirilmiştir. Boyutları (21 mm x 21 mm) bakımından piyasada bulunan diğer standart MEA'lardan farklıdırlar ve sabit bir kayıt odaları yoktur.
- Dezenfeksiyon için MEA'ları %100 etanol (2x), %70 etanol (1x) ve damıtılmış su (2x) içinde her biri en az 30 saniye durulayın. Kurumasını bekleyin. Temiz bir cam petri kabına (150 mm x 25 mm) 10 - 12 MEA koyun ve kapağı kapatın.
- MEA'ları 120 ° C'de 20 dakika boyunca otoklavlayın. RT'de saklayın.
- MEA'lar için kaplama solüsyonunu (malzeme listesine bakın) hazırlayın ve alikotları -20 °C'de saklayın.
- Her MEA'yı ayrı bir steril petri kabına (35 mm x 10 mm) koyun.
- Elektrotların üzerine 150 μl soğutulmuş kaplama solüsyonu koymak için soğutulmuş bir pipet kullanın ve petri kabının kapağını kapatın. Yaklaşık 10 dakika sonra, elektrotların üzerinde hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse kauçuk kaplı bir spatula ile nazikçe çıkarın. Oda sıcaklığında (RT) 1 saat dinlendirin.
- Kaplama solüsyonu kalıntılarını aspire edin, 1 katını doğum öncesi ve embriyonik nöronlar için optimize edilmiş ortamla ve 2 katını damıtılmış, steril suyla yıkayın. MEA'lar ertesi güne kadar kullanılmazsa, gece boyunca inkübatörde 37 °C'de damıtılmış, steril suda tutun (O/N). Aksi takdirde, doğrudan RT'de kurumaya bırakın.
2. Organotipik Kültürlerin Hazırlanması ve Büyümesi için Gerekli Malzemeler
- Kalsiyum içermeyen yıkama solüsyonu hazırlayın (malzeme listesine bakın).
- Tavuk plazmasını yıkama solüsyonunda sulandırın (1: 1, hafifçe çalkalayın, kabarcık oluşumunu önleyin), yaklaşık 20 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin ve berrak içeriği steril bir tüpe boşaltın. 200 μl'yi kriyotüplere alın ve -20 °C'de saklayın.
- Sığır plazmasından trombini uygun şekilde (200 U / ml) ve steril filtreden (0.2 μm gözenek filtresi) sulandırın. 200 μl'yi kritotüplere alın ve -20 °C'de saklayın.
- 30 kültür için 100 ml besin maddesi hazırlayın (malzeme listesine bakınız).
3. Omurilik Dokusu Diseksiyonu
Not: İşlem, embriyo sayısına bağlı olarak, yaklaşık 25 - 35 ko-kültür için omurilik dilimleri verir ve steril koşullar altında laminer akış başlığı içinde hazırlanır.
- Kas içi enjeksiyon ile anne hayvana öldürücü bir dozda pentobarbital (0.4 ml) uygulayın. Pedal çekme refleksini kontrol ederek derin anesteziyi onaylayın. Embriyonik gün 14 (E14) sıçan embriyolarını sezaryen ile teslim edin ve dekapitasyon ile kurban edin.
- Embriyoların gövdelerini steril, soğutulmuş, yıkama solüsyonu ile doldurulmuş bir petri kabına aktarın.
- Arka ayakların üzerinde bir neşter ve ön ayakların üzerinde bir tane daha ile tam bir enine kesim yapın ve uzuvları vücuttan çıkarın. Daha sonra, iç organları omuriliği içeren arka parçadan ayırmak için ön düzlemde bir kesi yapın.
- Dilimleme için, omuriliği içeren sırt parçalarını birer birer bir montaj diskine aktarın ve bir doku kıyıcı ile 225 - 250 μm kalınlığında kesin. Kıyılmış dokunun üzerine bir damla yıkama solüsyonu koyun ve steril, soğutulmuş, yıkama solüsyonu ile doldurulmuş 35 mm x 10 mm petri kaplarında bir spatula ile dilimleri aktarın.
- Her dilim için ayrı ayrı, omuriliği kalan dokudan ayırın. Dorsal kök gangliyonlarını bağlı bırakın.
- Dilimleri 4 °C'de 1 saat dinlendirin.
>4. Omurilik Doku Dilimlerinin MEA'lara Takılması
- Steril besin maddesini inkübatörde ısıtın (37 °C, oksijenasyon için hafifçe açılmış kapak).
- MEA'yı, elektrot dizisi odakta olacak şekilde stereo mikroskop altında petri kabında RT'de kauçuk kaplı uçlara sahip steril cımbızla konumlandırın. 6 μl'lik bir tavuk plazması damlacığını temiz, tozsuz ve steril elektrot dizisi üzerine ortalayın. Küçük bir spatula kullanarak, ventral kenarları birbirine bakacak şekilde iki omurilik bölümünü dikkatlice plazma damlacığına kaydırın. Elektrotlara spatula ile dokunmayın.
- Tavuk plazma damlacığının etrafına 8 μl trombin ekleyin. Trombin pipet ucunu kullanarak, tavuk plazması / trombin karışımını dikkatlice karıştırın ve iki dilimin etrafına yayın. Yine, kırılgan elektrot dizisine doğrudan dokunmayın. Pıhtılaşmadan hemen önce fazla tavuk plazmasını/trombini aspire edin.
- MEA/kültür düzeneği 37 °C'de inkübatörün içindeki nemlendirilmiş bir odada yaklaşık 1 saat otururken yüksek nemi korumak için petri kabını kapatın.
- Kültür odasına dikkatlice 10 μl besleyici ortam ekleyin, petri kabını kapatın ve yaklaşık 30 dakika inkübatöre geri koyun.
- Her bir MEA/kültür düzeneğini steril, kauçuk kaplı uçlarla bir silindir tüpe yerleştirin, 3 ml besleyici ortam ekleyin ve kapağı sıkıca kapatın. Silindir tüpünü, 37 ° C'de% 5 CO2 içeren bir atmosferde inkübatörde 1 - 2 rpm'de dönen silindir tamburuna yerleştirin.
- Besin ortamının yarısını 7 gün sonra in vitro (DIV) ve daha sonra haftada 1-2 kez değiştirin.
5. Mekanik Lezyonlar
- Steril, kauçuk kaplı uçlara sahip MEA/kültür düzeneğini silindir tüpünden çıkarın ve doku odakta olacak şekilde stereo mikroskop altında besleyici ortam içermeyen bir petri kabına yerleştirin. İki dilimin kaynaştığını görsel olarak doğrulayın.
- MEA'nın üzerine kauçuk kaplı uçlara sahip cımbız yerleştirerek MEA/kültür tertibatını sabit tutun.
- MEA'nın oluğuna doku dilimlerine yakın bir neşter bıçağı yerleştirin. Neşteri oldukça yatay tutun.
- Neşter sapını yukarı kaldırın, ancak neşter bıçağının, bıçak tabandan uca "yuvarlanacak" ve böylece oluğu kaplayan dokuyu kesecek şekilde MEA'nın oluğunda kalmasına izin verin.
- Gerekirse 25 G'lik bir iğne ucu ile kalan doku bağlantılarını şiddetlendirin. Sadece oluk içindeki alanda çalışın ve hassas kenarlara dokunmayın.
- MEA/kültür düzeneğini silindir tüpüne geri koyun. Kültürlere 3 ml taze besin ortamı sağlayın ve bunları inkübatördeki silindir tamburuna geri yerleştirin.
6. Spontan Aktivitenin Elektrofizyolojik Kayıtları
- Seçilen DIV sayısından sonra iki omurilik dilimi arasındaki fonksiyonel rejenerasyonu araştırmak için, MEA/kültür düzeneğini mikroskopta bir kayıt odasına monte edin ve yaklaşık 500 μl hücre dışı çözelti uygulayın (malzeme listesine bakınız).
- Sistemin stabilize olmasını sağlamak için ilk kayıttan önce 10 dakika bekleyin.
- RT'de MEA'nın her aktivite tespit elektrodundan yaklaşık 10 dakika boyunca temel spontan aktiviteyi 2x kaydedin.
- Kararlı hücre dışı koşulları sağlamak için, her kayıt oturumundan sonra hücre dışı çözelti alışverişinde bulunun.
