Tek Kullanımlık Biyoreaktörler Kullanılarak İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden Olgun Serebellar Organoidlerin Üretilmesi

Özet

Kaynak: Silva, T.P., et al. İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Olgun Serebellar Organoidlerin Ölçeklenebilir Üretimi ve İmmün Boyama ile Karakterizasyon. J. Vis. Uzm. (2020)

Bu video, tek kullanımlık bir 3D biyoreaktör kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) olgun serebellar organoidler üretme tekniğini göstermektedir. Biyoreaktör, daha sonra iPSC agregatlarının olgun serebellar organoidlere farklılaşmasını indükleyen büyüme faktörleri ve kemokinler açısından zenginleştirilmiş bir dizi kültür ortamı ile muameleye tabi tutulan iPSC agregat oluşumunu kolaylaştırır. Daha sonra, organoidler hasat edilir ve daha fazla analiz için dondurularak saklanır.

Protokol

1. Biyoreaktörde insan iPSC'lerinin tohumlanması

1. 10 μM ROCK inhibitörü Y-27632 (ROCKi) ile desteklenmiş mTeSR1'de tek tabakalar olarak büyütülen iPSC'leri inkübe edin. 6 oyuklu bir doku kültürü plakasından her bir oyuğa 1 mL takviye edilmiş ortam ekleyin ve 37 ° C,% 95 nem ve% 5 CO₂.
   'de 1 saat inkübe edin not: ROCKi, ayrışmış iPSC'leri apoptozdan korumak için kullanılır.
2. 1 saatlik inkübasyondan sonra, harcanan ortamı her bir oyuktan aspire edin ve 1x'i kuyucuk başına 1 mL 1× PBS ile yıkayın.
3. 6 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 1 mL hücre ayırma ortamı (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve hücreler hafif çalkalama ile oyuklardan kolayca ayrılana kadar 37 ° C'de 7 dakika inkübe edin.
4. Hücreler ayrılıp tek hücrelere ayrılana kadar hücre ayırma ortamını bir P1000 mikropipet ile yukarı ve aşağı pipetleyin. Enzimatik sindirimi etkisiz hale getirmek için her bir oyuğa 2 mL tam hücre kültürü ortamı ekleyin ve hücreleri nazikçe steril bir konik tüpe pipetleyin.
5. 210 × g'da 3 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
6. Hücre peletini kültür ortamında yeniden süspanse edin (ör., 10 μM ROCKi ile desteklenmiş mTeSR1) ve tripan mavisi boya kullanarak iPSC'leri bir hemositometre ile sayın.
7. 250.000 hücre/mL'lik nihai hücre yoğunluğunda 10 μM ROCKi ile desteklenmiş 60 mL mTeSR1 ile biyoreaktörde (maksimum 100 mL hacim) 15 ×¹⁰ 6 tek hücreli tohum.
8. 
   

4. 4. 
      
      
5. 
   
8. 
   
9. 
   
11. 
    
13. 
    
14. 
    
15. 
    

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
BrainPhys Nöronal Ortam N2-A ve SM1 kiti	5793 - 500 milyon	Kök hücre teknolojileri
Kimyasal olarak tanımlanmış lipid konsantresi	11905031	ThermoFisher (Termo Balıkçı)
Kristalizasyon ile saflaştırılmış BSA	5470	Sigma
DMEM-F12	32500-035	ThermoFisher (Termo Balıkçı)
Fetal sığır serumu	A3840001	ThermoFisher (Termo Balıkçı)
Sığır derisinden elde edilen jelatin	G9391	Sigma
Glutamax I	10566-016	ThermoFisher (Termo Balıkçı)
Dibütiril cAMP	SC- 201567B -500mg	Frilabo Balığı
Jambon'un F12'si	21765029	ThermoFisher (Termo Balıkçı)
İnsan Epizomal iPSC Hattı	A18945	ThermoFisher (Termo Balıkçı)	iPSC6.2
IMDM	12440046	ThermoFisher (Termo Balıkçı)
Insülin	91077C	Sigma
iPS DF6-9-9T.B		Wi Hücresi
İzo-pentan	PHR1661-2ML	Sigma
L-Askorbik asit	A-92902	Sigma
Matrigel (Matrijel)	354230	Corning	bodrum membran matrisi
Monotiyokliserol	M6154	Sigma
mTeSR1	85850 -500ml	Kök hücre teknolojileri
N2 takviyesi	17502048	ThermoFisher (Termo Balıkçı)
Nörobazal	12348017	ThermoFisher (Termo Balıkçı)
Paraformaldehit	158127	Sigma
PBS-0.1 Tek Kullanımlık Kap	SKU: IA-0.1-D-001	PBS Biyoteknoloji
PBS-MINI MagDrive Ana Birim	Ürün Kodu: IA-UNI-B-501	PBS Biyoteknoloji
Rekombinant insan BDNF	450-02	Peprotech teknolojisi
Rekombinant insan bFGF/FGF2	100-18B	Peprotech teknolojisi
Rekombinant insan FGF19	100-32	Peprotech teknolojisi
Rekombinant insan GDNF'si	450-10	Peprotech teknolojisi
Rekombinant insan SDF1	300-28A	Peprotech teknolojisi
KAYA inhibitörü	Y-27632 72302	Kök hücre teknolojileri
SB431542	S4317 Serisi	Sigma
Sakaroz	S7903 Serisi	Sigma
Doku-Tek O.C.T. Bileşiği	25608-930	VWR (VWR)

sayılı Kanun Serisi Serisi Serisi Sertifikası Serisi Serisi arası arası